全基因組拷貝數變異測序檢測胎兒生長受限染色體異常的診斷價值 *

羅小金，郭巖蕓，黃和明，韋升市，劉金星，陳婧，曹憲振，歐德標，白江濤

(1.深圳市龍崗區婦幼保健院中心實驗室，廣東深圳518172； 2.深圳市龍崗區人民醫院婦產科，廣東深圳518172)

在我國，胎兒生長受限(fetal growth restriction, FGR)發生率為6%～10%，是導致圍產死亡的主要原因之一[1]。導致FGR的因素比較復雜，主要包括胎兒、母體和胎盤因素，在胎兒因素中遺傳學的染色體和全基因組拷貝數變異(copy number variations, CNVs)是主要原因之一[2]。以往因傳統G顯帶染色體檢測技術的局限性，只能分辨大于10 Mb的染色體異常，部分病例是否因遺傳因素導致FGR或導致FGR的具體遺傳機制并不明確。近年來，隨著二代測序技術(next generation sequencing, NGS)在臨床上的廣泛應用，研究表明，基于NGS的全基因組拷貝數變異測序(copy number variation sequencing, CNV-Seq)相較于傳統核型分析、多重連接依賴性探針擴增(MLPA)、熒光原位雜交(FISH)及染色體微陣列分析(CMA)等技術具有高分辨率，高準確性和高基因組覆蓋率等優勢，可以檢出100 kb以上的染色體拷貝數變異情況[3]。本研究通過對138例FGR胎兒同時進行G顯帶核型分析和CNV-Seq檢測，評估基于NGS的低深度全基因組CNV-Seq在明確產前診斷FGR染色體異常的臨床價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2018年4月至2020年10月深圳市龍崗區婦幼保健院因超聲診斷為FGR且進行侵入性產前診斷分析的138例胎兒，均行G顯帶核型分析和CNV-Seq檢測。孕婦年齡(29±4)歲，初產婦94例，經產婦44例，胎兒診斷為FGR時的孕周為(24±3)周，行侵入性產前診斷時的孕周為(25±3)周。FGR診斷標準：綜合末次月經、月經史及早孕期B超確定孕齡，利用Hadlock公式計算胎兒體重，低于同孕周正常胎兒平均體重的第10百分位數定義為FGR。排除明確由母體妊娠期高血壓疾病、母體感染及母體營養因素異常等原因引起的FGR。本研究經過龍崗區婦幼保健院醫學倫理委員會審核批準(No.LGFYYXLL-028)，各研究對象及家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，T4 DNA聚合酶、KlennowDNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶(美國ABI公司)，寡核苷酸試劑盒(美國Illumina公司)，PCR擴增產物純化試劑盒(美國Beckman Coulter公司)，吉姆薩染液(珠海貝索公司)，羊水培養基(廣州和能生物公司)。PCR擴增儀(美國Thermo Fisher公司)，2100 Bio-analyzer 生化分析儀(美國Agilent公司)，HiSeq2000高通量測序儀(美國Illumina公司)，CDS-5染色體分散儀(美國Thermotron公司)，LeicaGSL120全自動核型掃描分析系統(德國Lecica公司)。

1.3CNV-Seq檢測 無菌條件下穿刺取10 mL羊水，1 600 r/min離心10 min，去上清液，按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA備用，用超聲波打斷、末端修復、加polyA尾和接頭，加入引物PCR，構建DNA文庫，采用Agilent2100生物分析儀和熒光定量PCR對文庫進行定量質控。采用HiSeq2000測序平臺按50SE單末端10 M數據量進行測序，CNV-Seq檢測要求每例DNA量≥10 ng。通過Genome Analyzer Ⅱx分析軟件對比將每個測序標簽匹配到對應染色體，進行標準化Z值分析，并進行染色體CNV的判定，檢測范圍為>100 kb的CNVs。檢出的CNVs與人類基因組拷貝數變異數據庫(Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Human using Ensembl Resourses, DECIPHER)、人類基因組拷貝數變異多態性數據庫(Database of Genomic Variants, DGV)和在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)進行匹配比對分析。根據美國醫學遺傳學會(American College of Medical Genetics, ACMG)指南[4]，CNVs判讀分類為致病性/可能致病性臨床意義不明拷貝數(VOUS)，可能良性/良性。

1.4核型分析 無菌條件下穿刺取15～20 mL羊水，1 600 r/min離心10 min,去上清液，常規方法[5]進行細胞接種培養、收獲、制片及G或N顯帶染色體核型分析，使用LeicaGSL120全自動核型掃描分析系統掃描玻片上的100個分裂相，挑選長短適中、分散良好核型計數20個，隨機分析5個，嵌合體及異常核型加倍計數至100個。核型診斷標準依據人類細胞遺傳學國際命名體系(ISCN2016)[6]判讀。

1.5短串聯重復序列(STR)檢測 按照ABI 3130測序儀及Identifier Plus試劑盒說明書對羊水和外周血標本D3S818、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、PENTAE、AMELOGENIN等15個STR基因座進行檢測，應用GeneMapper V3.2自動分析軟件進行STR基因分型，平行分析以檢測是否存在母體組織污染。

1.6統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料組間率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CNV-Seq與G顯帶核型分析對>10 Mb染色體異常的檢出結果 138例FGR病例中G顯帶核型分析檢出12例>10 Mb染色體異常(8.7%,12/138)，包括3例數目異常(分別為2例21三體和1例45,X)、9例結構異常(分別為2例平衡易位、4例缺失或重復和1例新衍生染色體)，還檢出1例低比例嵌合體。CNV-Seq檢出9例>10 Mb染色體異常(6.5%,9/138)，2例平衡易位(分別為病例11、12)和1例(病例10)低比例嵌合體(表1)。

表1 核型異常的FGR病例中CNV-Seq檢測結果分析

2.2CNV-Seq和G顯帶核型分析對<10 Mb染色體CNVs的檢出結果 138例FGR病例中G顯帶核型分析檢出1例(病例18)<10 Mb染色體異常。CNV-Seq檢測出11例<10 Mb染色體CNVs(8.0%,11/138)，其中致病性CNVs 8例(5.8%，8/138)(病例13～20)，包括2例Williams-Beuren綜合征、2例16p微缺失/微重復綜合征、1例Miller-Dieker綜合征、1例Wolf-Hirschhorn綜合征、1例3q29缺失綜合征，1例2號染色體父源單親二倍體(uniparental disomy, UPD)，均涉及生長發育遲緩、智力障礙或超聲結構異常等相應的綜合征表型。另外檢出3例VOUS(2.2%,3/138)(病例21～23)，主要包括2例微缺失和1例微重復(涉及片段0.2～0.5 Mb)，所含致病基因包括ERCC8、NDUFAF2、FUT3、FUT6、ADAMTS2、GRM6、WWOX(表2)。

表2 核型正常FGR病例中異常CNV-Seq檢測結果分析

2.3CNV-Seq與G顯帶核型分析對FGR檢測結果的對比 138例FGR標本中采用G顯帶核型分析檢出染色體異常13例(9.4%,13/138)，采用CNV-Seq檢出20例(14.5%,20/138)。兩種方法對非整倍體異常和>10 Mb的CNVs的檢出率均為4.3%(6/138)，差異無統計學意義(χ2=0.000,P>0.05)。對<10 Mb的CNVs的檢出率分別為0.7%(1/138)和3.5%(12/138)，差異有統計學意義(χ2=9.768,P<0.05)。G顯帶核型分析檢出平衡易位/嵌合體3例(2.2%)，CNV-Seq未能檢出上述病例。見表3。

表3 核型分析和CNV-Seq對138例FGR病例的檢測結果對比分析[n(%)]

3 討論

FGR的發病涉及多種因素，傳統觀點認為5%～20%的FGR由胎兒染色體異常所導致[7]。研究顯示，239例FGR胎兒同時行核型分析和CMA技術可檢出染色體異常37例(15.5%)，證實核型分析結合CMA可顯著提高FGR染色體異常檢出率[8]。相較于傳統核型分析，本研究使用的CNV-Seq技術具有高通量、高分辨率和高敏感性等優勢，相較于全基因組高通量測序具有深度低、耗時短和成本低等優勢。本研究中，采用G顯帶核型分析結合CNV-Seq技術共檢出染色體異常16.7%(23/138)，此外，采用CNV-Seq技術額外檢出7.2%(10/138)染色體CNVs，證實CNV-Seq應用于產前檢測染色體CNVs與CMA具有同等檢出功效。相較于CMA技術，CNV-Seq具有全基因組均勻覆蓋的優點[9]。本研究中2例平衡易位CNV-Seq未能有效檢出，原因在于目前CNV-Seq測序法為單端測序，無法檢出不涉及基因劑量改變的染色體異常。理論上平衡易位不存在遺傳物質增減，但不排除斷裂點破壞關鍵基因表達導致胚胎停育。本研究中通過G顯帶核型分析檢出1例(病例12)X與6號染色體平衡易位，其斷裂點位于Xp22的矮小同源盒(short stature homeobox containing,SHOX)基因區域，SHOX基因缺陷與身材矮小關系密切，屬于單倍劑量敏感性基因，其雜合缺失或變異可造成Leri-Weill軟骨生成障礙或特發性身材矮小[10]。

研究顯示，在核型正常的FGR或合并其他超聲異常的FGR病例中，基因芯片能額外檢出8%的染色體CNVs[11]。本研究在核型正常的125例FGR胎兒中，采用CNV-Seq技術額外檢出7.2%(10/138)小于10 Mb染色體CNVs。致病性CNVs因基因劑量改變、基因斷裂及位置效應等方式干擾基因編碼蛋白的功能，可導致相應的FGR及其他臨床特征[12]。本研究檢出的6例致病性CNVs中除1例單親二倍體外，其他5例均具有明確的綜合征臨床表型。有文獻資料顯示，Williams-Beuren綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Miller-Dieker綜合征和16p11重復綜合征在胎兒時期主要表現為生長發育遲滯、多器官畸形等臨床表型，胎兒FGR是其產前超聲較為明顯的指征[13]。本研究顯示CNV-seq在產前可以檢出傳統G顯帶核型無法檢出的與FGR相關的微缺失微重復綜合征，可有效明確其遺傳學致病機制。

本研究中的病例18為新發突變的VOUS，區域內含ERCC8和NDUFAF2致病基因，但該胚胎停育是否上述基因雜合缺失導致，還需進一步的功能實驗驗證。病例19～20的VOUS為遺傳自雙親之一，雖缺失/重復區域內含致病基因，但均足月分娩表型正常嬰兒。現行CNVs分類中，VOUS的評分標準(-0.89～0.89)比較寬泛，VOUS的檢出容易對實驗室技術人員和遺傳咨詢醫師造成極大困擾。產前檢出VOUS后，父母行CNV-Seq檢測有助于結果解釋和明確遺傳學病因。通常認為VOUS遺傳自雙親之一時，其臨床意義相對較小，VOUS為新發突變時則反之，但無論是遺傳還是新發，均可因外顯率和表現度的差異導致臨床表型不一致[14]。

本研究還發現，在138例FGR病例中，G顯帶核型分析和CNV-Seq對染色體非整倍體異常和>10 Mb的CNVs檢出率基本一致，通過對比分析，差異無統計學意義(χ2=0.000,P>0.05)。而對于<10 Mb的微缺失/微重復綜合征的檢出，CNV-Seq相較于G顯帶核型分析具有顯著優勢，CNV-Seq能額外檢出10例(7.2%,10/138)與FGR相關的小片段致病性CNVs。然而，CNV-Seq也存在技術局限性，例如不能檢出平衡易位和倒位、低比例嵌合、點突變等[15]。作為新興的診療技術，CNV-Seq在臨床應用仍存在頗多挑戰，尚有較多檢測的CNVs無法作出合理的臨床解釋[16]。

綜上所述，本研究通過與傳統的G顯帶核型分析對比分析，明確了基于NGS技術的CNV-Seq除可準確檢出產前FGR常見的涉及大片段CNVs的染色體非整倍體和結構異常外，還能有效檢出10 Mb以下的致病性CNVs及其導致的相關微缺失和微重復綜合征，能更系統地揭示FGR的遺傳學病因，科學指導孕婦妊娠選擇。