2種重疊延伸PCR技術構建5種立克次體融合基因的方法學比較 *

鄭雨桐，閆美田，萬楠

(1.大連醫科大學研究生院，遼寧大連 116044；2.中國人民解放軍北部戰區總醫院檢驗科，沈陽 110016)

重疊延伸PCR(overlaping extension PCR, SOE-PCR)技術最早于1989年由Horton等[1]創建，經過30多年的探索研究，現已是分子生物學及基因工程研究領域中較為常見的PCR技術。該方法是通過設計內部具有重疊部分的特異性引物，經PCR，將2個及2個以上的基因片段拼接起來的過程[2]。與傳統的基因融合重組構建方法不同，SOE-PCR技術無需限制性內切酶和DNA連接酶的處理[3]，是一種方便、快捷及有效的分子生物學方法。

隨著研究的不斷進展，基于SOE-PCR技術可以將多個DNA片段同時無縫融合在一起，目前已獲得的最大融合基因片段長度超過2×104bp[4]。利用此技術可以在目的序列中引入突變、刪除和替換位點等[5]。另外，此技術還可以將若干個短的相互重疊的引物拼接起來進行全基因合成[6]。但是該技術在實驗過程中仍有許多不足之處，例如在實驗開始時必須使用特異性引物將各基因片段進行單獨擴增后才能進行基因融合，即需要進行2次PCR反應(兩步SOE-PCR法)，不僅耗時，而且增加了實驗成本。基于繁瑣的兩步法，本實驗設計出一步SOE-PCR法，將整個實驗PCR反應減少至1次；并采用一步法及兩步法SOE-PCR分別對普氏立克次體、嗜吞噬細胞無形體、莫氏立克次體、羌蟲病東方體、貝氏柯克斯體5個基因片段進行拼接融合，并對2種方法進行比較性分析，為SOE-PCR技術及更多的基因融合提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1研究對象(靶基因選取與質粒) 從NCBI基因數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載普氏立克次體(AF123718)、嗜吞噬細胞無形體(AF153716)、莫氏立克次體(KF241858)、羌蟲病東方體(RIRGM47G)、貝氏柯克斯體(AF146298)全基因序列，通過BLAST分析找到保守且特異的序列并由通用生物系統公司合成基因片段。

1.2儀器與試劑 pGMT-easy克隆載體、pGMT-easy連接試劑盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、2×TransStart FastPfu PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、瓊脂糖凝膠粉劑均購自北京全式金生物技術公司，50×TAE購自北京賽文創新生物科技公司。AG 5333型PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司，瓊脂糖凝膠電泳儀購自美國Bio-Rad公司，UVP凝膠成像儀購自美國UVP公司。

1.3方法

1.3.1引物設計及驗證 5對特異性引物合成由上海生工公司完成，片段大小及引物設計序列見表1。將5個靶基因質粒及5對特異性引物分別構建50 μL PCR擴增體系進行PCR擴增，體系中各成分含量包括：靶基因質粒模板1 μL，10 μmol/L上、下游特異性引物各1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。循環參數：96 ℃ 5 min；96 ℃ 22 s，56 ℃ 22 s，72 ℃ 25 s，共30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增結束后進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并通過UVP凝膠成像儀觀察是否擴增出相應的5個目的基因。

表1 5種立克次體靶基因的選取及重疊引物的設計

1.3.2一步法SOE-PCR 以5個靶基因質粒為模板，構建50 μL PCR擴增體系，體系中各成分含量如下：5個模板各1 μL，設計出的5對重疊引物各1 μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。循環參數：96 ℃ 5 min；96 ℃ 22 s，56 ℃ 22 s，72 ℃ 25 s，共5個循環；72 ℃ 5 min；反應結束后將循環參數調整為：96 ℃ 22 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共5個循環；72 ℃ 5 min。待反應結束后取出產物，加入另外50 μL反應體系，體系中各成分含量如下：普氏立克次體F與貝氏立克次體R(10 μmol/L)各1 μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。循環參數：96 ℃ 22 s， 60 ℃ 1 min，72 ℃ 25 s，共30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。為了能獲得均一性較好的融合基因，本實驗對反應過程中重疊引物的濃度進行優化，梯度如下：10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L、1 μmol/L、0.5 μmol/L、0.25 μmol/L、0.1 μmol/L、0.05 μmol/L、0.025 μmol/L、0.01 μmol/L。分別按上述濃度進行一步法SOE-PCR，獲得的融合基因產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并通過UVP凝膠成像儀觀察結果。

1.3.3兩步法SOE-PCR 以5個靶基因質粒為模板，構建50 μL PCR擴增體系，分別擴增出相應的目的基因產物(此過程中重疊引物濃度為10 μmol/L)，獲得的產物無需進行回收純化處理。將5種目的基因產物進行等體積混合，構建50 μL PCR擴增體系，除等體積混合的產物外，體系中其他各成分含量如下：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補足至50 μL(此步驟無需加入任何引物)。循環參數：96 ℃ 22 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共5個循環；72 ℃ 5 min；待反應結束后取出產物，加入另外50 μL反應體系，體系中各成分含量如下：普氏立克次體F與貝氏立克次體R(10 μmol/L)各1 μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。循環參數：96 ℃ 22 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 25 s，共30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。為了能獲得均一性較好的融合基因，本實驗對各靶基因產物加入量進行優化，梯度如下：0.1 μL、0.15 μL、0.2 μL、0.25 μL、0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL。分別按上述體積進行兩步法SOE-PCR，獲得的融合基因產物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并通過UVP凝膠成像儀觀察結果。

1.3.4測序驗證 將2種不同方法獲得的最佳融合基因產物送往上海生工公司進行測序。測序結果用Chromas及Seqman軟件進行比對分析。

2 結果

2.1引物驗證 將5個靶基因質粒分別進行PCR擴增，結果中出現5個相應片段長度的條帶，表明本研究所設計的引物可以擴增出相應的目的基因。見圖1。

注：1～5分別為普氏立克次體(364 bp)、嗜吞噬細胞無形體(132 bp)、莫氏立克次體(213 bp)、羌蟲病東方體(127 bp)、貝氏柯克斯體(76 bp);M,DNA Marker。

2.2一步法融合基因檢測結果 利用方法1.3.2進行一步法SOE-PCR，電泳結果顯示均可擴增出長度約為912 bp的目的基因條帶，初步證明5條目的基因已融合成1條；另外，當重疊引物的濃度為0.1～0.01 μmol/L時，912 bp的融合基因條帶亮度較高，且雜帶較少。見圖2。

注：M, DNA Marker；1～10，重疊引物濃度梯度分別為10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L、1 μmol/L、0.5 μmol/L、0.25 μmol/L、0.1 μmol/L、0.05 μmol/L、0.025 μmol/L、0.01 μmol/L。

2.3兩步法融合基因檢測結果 利用方法1.3.3進行兩步法SOE-PCR，電泳結果顯示均可擴增出長度約為912 bp的目的基因條帶，初步證明5條目的基因已融合成1條；另外，當各靶基因產物加入量為0.1～0.25 μL時，912 bp的融合基因條帶亮度較高，且雜帶較少。見圖3。

注：M, DNA Marker；1～10，各靶基因產物加入量梯度分別為0.1 μL、0.15 μL、0.2 μL、0.25 μL、0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL。

2.4測序驗證結果 2種不同方法獲得的最佳融合基因產物測序結果與融合基因序列進行比對，結果顯示一步法和兩步法PCR產物中均含有與融合基因全長序列完全相同的部分，因此，該2種方法構建融合基因均獲得成功。見圖4。

注：A為一步法融合基因產物部分測序結果比對結果；1，部分融合基因序列；2，一步法測序部分序列結果；3，一步法融合基因產物部分測序峰圖；B為兩步法融合基因產物部分測序結果比對結果；4，兩步法測序部分序列結果；5，兩步法融合基因產物部分測序峰圖。

3 討論

1989年SOE-PCR技術問世，實現了將不同或相同來源的不同基因片段“拼接”，與傳統的基因重組構建方法相比，這種功能強大且技術簡單的方法具備許多優勢[7-9]。在實際科研工作中，我們發現多數研究人員會選擇兩步SOE-PCR方法，例如伊強等[10]通過兩步SOE-PCR方法構建了EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因；龔詠晴等[11]通過兩步法構建與子宮內膜癌相關的PTEN基因3位點的融合重組載體；董巍檑等[12]通過兩步法將exon18和exon20片段進行融合，且成功構建了宮頸癌相關的EGFR基因重組表達載體。

本實驗通過2種不同步驟的SOE-PCR方法，均成功將5種立克次體目的基因“拼接”在一起。應用一步法進行基因融合時，重疊引物的濃度需在0.1 μmol/L以下，可融合出單一程度較高的912 bp全長基因，即重疊引物的濃度與融合基因上、下游引物的濃度比例需在1∶100以下。與陳國梁等[13]運用一步法SOE-PCR進行的3種淀粉合成關鍵酶的融合結果相似。另外，運用傳統兩步法進行基因融合時，以第一步獲得的5個目的基因產物為模板加入量需控制在0.1～0.25 μL之間，可融合出單一程度較高的912 bp全長基因。將2種方法進行對比發現，一步法融合基因操作簡單，耗時短(所用時間約為兩步法的二分之一)，同時DNA聚合酶用量較少；但在反應體系中一次性加入所有模板及引物，退火過程中，模板的互補配對部位會進行拼接，同時引物也在退火，模板的拼接和擴增將會同時進行，這樣就相對降低了擴增初始階段的模板濃度，導致最終融合基因產物濃度較低。因此，一步法中重疊引物濃度、退火溫度及退火時間的把握至關重要。兩步法融合基因耗時較長，過程較為繁瑣，但由于先分別擴增出5個目的基因產物，故而僅存在少量非特異性擴增，目的基因濃度較高。但由于在基因融合過程中并不存在擴增反應，只是單純的互補延伸，所以在第二步反應的初始階段需要加入較高濃度的目的基因產物，從而獲得大量融合基因。因此，大量的耗材是兩步法融合基因的另外一個缺點。從上述分析中發現一步法SOE-PCR可以更加經濟、簡單、高效地完成多個基因片段的融合。

無論進行何種基因融合方法時，為確保融合成功，應注意以下多個方面：(1)引物重疊部分的設計：徐芳等[14]認為SOE-PCR技術應注重重疊引物的設計，除應考慮引物設計的一般原則外，還應考慮重疊部分的長度，并建議重疊部分序列長度為15～20 bp。另外，還應注意重疊引物的Tm值，建議設計所有引物的Tm值應相同或相近，有助于提高融合效率。(2)DNA聚合酶的種類：由于普通Taq酶進行PCR擴增反應時，會在3′末端添加A，造成移碼突變，因此選用高保真聚合酶是良好的選擇，從而為后續實驗的成功奠定基礎。(3)退火溫度的控制：一步法SOE-PCR在退火過程中，模板的拼接和擴增將會同時進行，因此適當提高退火溫度及延長退火時間可以提高融合基因的效率。

綜上所述，本研究成功通過SOE-PCR技術在體外將5種立克次體進行融合，但本實驗仍然存在以下不足：如僅對2種方法的重疊引物的濃度及目的基因產物加入量進行優化，其他環境參數(例如最合適的引物長度、最佳連續延伸的循環數、最佳退火溫度及時間等)主要是通過實驗經驗進行掌控，這些問題還需要進一步實驗證實。另外，后續實驗中我們將繼續進行立克次體融合基因表達載體構建，同時為立克次體分子生物學多重檢測提供實驗模板。