溫針灸與骨髓間充質干細胞移植對兔膝骨性關節炎模型血清中MMP-1、 MMP-13和IL-10表達的影響

張艷玲，楊 磊，劉君偉，陳人智，馬遇原，武永利，3

膝骨性關節炎(KOA)是由軟骨外基質降解與修復動態失衡，致膝關節功能障礙的疾病。基質金屬蛋白酶-1、13(MMP-1、13)可直接降解對軟骨基質起支撐作用的Ⅱ型膠原，加重膝關節炎癥反應和臨床癥狀?？寡滓蜃影捉樗?10(IL-10)能夠促進成骨細胞的增殖與分化，抑制破骨細胞破壞以減緩KOA進展。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有免疫抑制和抗炎作用，在KOA軟骨缺損修復治療中具有重要作用，溫針灸治療KOA療效確切[1]。本實驗探討溫針灸聯合 BMSCs 移植對KOA的治療作用，研究其效果與炎癥因子表達水平的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物及細胞系：50只新西蘭大耳兔均為6月齡，體重2.5～3 kg，購自寧夏醫科大學實驗動物中心(動物許可證號：SCXK2016-0007)，雌雄不分。實驗過程中的動物相關操作符合動物倫理學要求。2018年7月-2019年9月在寧夏醫科大學實驗動物中心完成動物實驗，在重點實驗室完成實驗操作。BMSCs(RBXMX-01001)購自賽業生物公司。

1.1.2 實驗動物分組與造模：將50只大耳兔隨機分為5組(n=10)，即：空白組(CT組)、模型組(Model組)、溫針灸組(WNM組)、骨髓間充質干細胞組(BMSCs組)、溫針灸聯合骨髓間充質干細胞組(WNM+BMSCs組)。除CT組外，采用右后肢伸直位石膏管型固定其余4組，固定6周以制備中期兔KOA模型，造模成功后，進行試驗干預。

1.2 主要試劑：BMSCs完全培養基(賽業生物公司，批號：RBXMX-90011)；L-DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(Gibco)；ELISA 試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；全蛋白提取試劑盒、一抗:MMP-1、MMP-13單克隆抗體(Abcam)，山羊抗兔二抗(BOSEN)；細胞培養箱(Sanyo)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與傳代：將購買的P1代兔源的BMSCs培養在兔間質干細胞完全培養基中，常規培養，此后依據細胞生長情況2～3 d換液1次。7～8 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞可達到達80%～90%融合率后，進行傳代培養至P3代為實驗對象。

1.3.2 自體血小板裂解液制備：造模前將WNM組、BMSCs組兔抽取耳背靜脈血10 mL，放入含抗凝劑的離心管中，以5 000 r/min，離心20 min后獲取上層清液，分裝后于-20 ℃冰凍12 h后，保存于-80 ℃冰箱中；經37 ℃水浴融化，再次離心(5 000 r/min，20 min)后使用。

1.3.3 BMSCs懸液制備：預熱完全培養基、血小板裂解液、0.25%胰蛋白酶至37 ℃，P3代BMSCs用胰酶消化3 min，鏡下見細胞突起回縮，形態近卵圓形時，用含血清的完全培養基終止消化。仔細吹打后離心5 min(1 000 r/min)，小心棄去上清液，重懸加入的自體血小板裂解液，調整細胞濃度至1×106/mL，分裝30支0.5 mL的BMSCs懸液備用。

1.3.4 治療方法與標本收集：在相同的無菌實驗環境下，對造模成功后的各組兔給予相應干預，1個療程7 d，共處理2個療程，5組實驗兔于療程結束當天同時取材。① CT組：不予處理，正常飼養。②Model組：僅每天固定于兔架上15 min，不做其它干預。③ WNM組：先針刺內外膝眼、鶴頂、足三里穴，針刺得氣后，將針柄上端施加艾條(1 cm)由近端點燃，每個穴位施灸3壯，每日1次。④ BMSCs組：0.5 mL的BMSCs懸液(P3，1×106個)通過內膝眼向關節腔內注射治療，每個療程注射1次。⑤WNM+BMSCs組：每個療程的第1天先通過內膝眼向關節腔內注射0.5 mL經自體血小板裂解液懸浮的BMSCs(P3，1×106個)，剩余6 d給予溫針灸治療。2個療程后試驗兔耳緣靜脈空氣栓塞處死，經腹主動脈采血，室溫血液自然凝固20 min，3 000 r/min離心5 min，仔細吸取血清放入EP試管中，保存于-70 ℃冰箱中，統一檢測。

1.3.5 軟骨損傷評分：對實驗兔膝關節軟骨組織，依據 Mankin 法[2]進行損傷程度評分。①軟骨結構:正常，0 分；表面不平整，1 分；表面不平整且有血管翳形成，2分；裂隙進入過渡層，3分；裂隙進入輻射層，4分；裂隙進入鈣化層，5分；結構完全破壞，6 分。②軟骨細胞：正常，0 分；細胞呈彌漫性增加，1 分；局部細胞明顯增多，2 分；細胞數目明顯減少，3 分。③軟骨基質染色：正常，0 分；輕度減少，1 分；中度減少，2 分；重度減少，3 分；無著色，4 分。④ 潮線完整性：完整性良好，0 分；完整性差，1 分。

1.3.6 ELISA 法檢測細胞因子表達：兔KOA血清中MMP-1和 MMP-13、IL-10的含量使用 ELISA 法檢測，具體步驟按試劑盒說明進行操作。

1.3.7 Western blot 檢測：提取培養干預后各組細胞總蛋白；按照BCA試劑盒操作步驟，配置10%的分離膠和4%的濃縮膠，對蛋白含量進行測定；經過上樣、電泳及轉膜后，加入一抗(濃度為1∶100)，4 ℃輕搖過夜；完成孵育、洗膜后，選擇與一抗來源合適的二抗工作液(濃度為1∶10 000)，室溫輕搖1 h；二抗孵育完成后再洗膜，辣根過氧化物酶 HRP-ECL 發光法曝光，進行統計分析。

2 結果

2.1 各組Mankin評分比較：Model組Mankin評分高于CT組(P<0.05)；治療后WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組Mankin評分均比MX組低(P<0.05)，但比CT組升高(P<0.05)。WNM+BMSCs組Mankin 評分低于WNM組與 BMSCs 組(P<0.05)，見表 1。

表1 各組膝骨關節炎Mankin評分比較(分，

2.2 各組治療前后血清中MMP-1、 MMP-13和IL-10水平變化情況比較：造模成功后，與CT組對比，其余各組血清中MMP-1和MMP-13水平均明顯升高，IL-10水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。給予各組相關干預，2個療程后與Model組相比，WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組MMP-1和 MMP-13 均下降，而IL-10升高，差異有統計學意義(P< 0.05)，且WNM+BMSCs組明顯優于BMSCs組，差異有統計學意義(P<0.05)；Model組治療前后血清中MMP-1和 MMP-13水平變化差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組治療前后血清中MMP-1、MMP-13和IL-10表達水平比較

2.3 采用Western blot 檢測結果比較：與CT組對比，Model組MMP-1、13蛋白的含量顯著性升高(P<0.05)；與Model組相比，WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組MMP-1和MMP-13蛋白水平均下降，差異有統計學意義(P< 0.05)，且WNM+BMSCs組明顯低于BMSCs 組(P<0.05)，見表3、圖1(目錄后)。

表3 各組血清中MMP-1、MMP-13蛋白含量比較

3 討論

3.1 細胞因子在KOA病理過程中的作用:KOA的發生主要與軟骨細胞凋亡導致KOA關節軟骨完整性破壞密切相關，軟骨細胞在炎性因子作用下凋亡，促進KOA病情的發生進展。MMP-1、MMP-13是基質金屬蛋白酶家族中的一員，屬于膠原蛋白水解酶，作為KOA中的關鍵酶，在生物學與力學因素的影響下，可以直接作用于Ⅱ型膠原蛋白，不可逆地降解細胞外基質。MMP-1在 OA關節軟骨退變的過程中，促進軟骨細胞合成-分解代謝平衡的破壞，其水平表達的高低，直接影響著OA病理發展[3]。研究表明，MMP-1 在 兔OA模型水平表達明顯增高，其活性與軟骨退變程度呈正相關性[4-5]。潘朝旺等[6]研究表明，金蕎麥提取物可明顯下調兔模型軟骨組織MMP-1表達，減輕其對軟骨組織的降解破壞，進一步保護軟骨組織，起到治療骨關節炎作用。課題組前期研究發現，溫針灸治療后關節軟骨中MMP-1、MMP-13的mRNA及蛋白表達較模型組明顯降低，說明溫針灸通過引起MMP-1、MMP-13表達下降，進一步反向調控JNK信號通路，從而改善KOA的疼痛與關節功能障礙[7]。

IL-10主要由T細胞亞群Th2分泌產生，體內所有的單核巨噬細胞作為IL-10的靶細胞，作為正向調節因子，IL-10通過促進釋放抗炎因子，進而抑制巨噬細胞活性，與OA 疾病的發病進展密切相關[8]。IL-10 具有重要的免疫應答作用，當病原體及炎癥因子侵犯人體時IL-10參與發揮機體的免疫調節作用[9]，其水平的上調能抑制體內過度表達和釋放炎癥因子TNF-α、IL-1，抑制炎癥反應，起到減緩KOA關節腫脹疼痛的作用[10]。王繼猛等[11]研究發現弱激光照射后大鼠脊髓損傷組織內IL-10水平增加，除外改善損傷的局部微環境，拮抗前炎癥因子引起的繼發性炎性反應，更因增加的IL-10水平，直接表現出對神經保護的直接作用。潘建科等[12]研究顯示，龍鱉膠囊能有效地治療KOA，消除KOA大鼠的的臨床癥狀，尤其改善大鼠KOA模型膝關節腫脹，且其產生的作用與升高大鼠血清IL-10水平，降低IL-1β、IL-6水平密切相關。

本研究結果發現，2個療程后與Model組相比，WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組軟骨降解產物MMP-1和 MMP-13 均下降，而抗炎因子IL-10升高，且WNM+BMSCs組治療效果明顯優于BMSCs組及WNM組，可以在很大程度上調控炎癥因子及抗炎因子的表達水平，抑制炎癥因子表達，同時促進抗炎癥因子的水平增高，起到減緩抑制軟骨降解，達到治療KOA的作用。

3.2 溫針灸與BMSCs 對KOA的治療作用：KOA是中老年人常見高發病，嚴重影響著患者的生活質量。KOA的主要病因病機為“本虛標實”，表現為氣血肝腎虧虛，再感受風寒等外邪，引起氣血不通，經脈失養,脈絡瘀阻而發生KOA。溫針灸是祖國醫學治療KOA主要外治法，具有針刺與艾灸的雙重作用，針刺法調整氣血陰陽平衡，活血通絡以“通則不痛”，配合灸的熱敏刺激，調節炎癥因子的表達，達到活血通絡、溫通經脈、止痛的作用。課題組前期已證實溫針灸具有益氣養血、溫陽補虛、散寒逐瘀的功效，所選干預穴位為雙側內外膝眼、鶴頂、足三里，通過局部及陽明經取穴可加強膝關節周圍組織內血液循環，加快軟骨細胞新陳代謝，調節相關細胞因子參與的信號通路等表達，治療中遠期KOA療效確切。

BMSCs具有多向分化潛能，在治療KOA中發揮許多潛能，可直接分化為軟骨細胞，參與膝關節軟骨基質組織重建及修復損傷關節，并能夠合成生物相關活性因子，類似溫針灸局部取穴作用，使血管再生通道激活，進而營養軟骨。通過給予KOA大鼠關節腔注射BMSCs，可明顯降低大鼠血清中炎性因子的表達，可抑制因膠原表達失調所致關節軟骨組織的損害。課題組前期證實溫針灸聯合BMSCs移植可增加Ⅱ型膠原合成，通過減緩軟骨細胞凋亡而抑制兔KOA軟骨組織損傷[13]。秦豐偉[14]研究結果示BMSCs移植可降低兔KOA關節中炎癥因子IL-1、TNF-α、MMP-3的表達，升高抗炎因子IL-10水平，抑制炎癥反應的發生進展，從而改善關節軟骨的破壞。

本次試驗應用全貼壁法培養BMSCs，應用專用培養基進行純化傳代和擴增至P3代，細胞形態長梭形，單一均勻，生長良好。造模后給予BMSCs組、WNM+BMSCs組關節腔內注射P3代BMSCs，結果顯示兔KOA模型軟骨損傷Mankin 評分降低，關節腫脹減輕，關節功能活動度改善，體現了BMSCs對兔KOA的治療作用，且下調了MMP-1、MMP-13表達，上調IL-10水平，發揮了免疫調節作用，治療兔KOA 有效。WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組 MMP-1、MMP-13蛋白表達水平較Model組均明顯降低，且WNM+BMSCs組蛋白水平低于BMSCs組及WNM組，差異有統計學意義，說明溫針灸與BMSCs移植聯用能夠降低軟骨細胞 MMP-1、MMP-13蛋白表達水平，從而減緩軟骨基質的降解，防治KOA的進展。

綜上所述，溫針灸與BMSCs 移植可以降低兔KOA血清中MMP-1和 MMP-13表達，升高抗炎因子IL-10表達水平，可能通過降低因炎性介質和因子增加而誘發的軟骨細胞凋亡，抑制滑膜和軟骨細胞產生炎癥反應，延緩軟骨退變，恢復軟骨細胞功能來治療兔KOA，與單純溫針灸和單純 BMSCs 移植治療相比，聯合使用的治療效果顯著。對于溫針灸和 BMSC 移植與炎性因子介導相關信號通路抗軟骨細胞凋亡的作用機制，尚待進一步研究完善。