HBV相關性肝臟疾病患者血清乙型肝炎核心相關抗原檢測的臨床應用研究進展

冉紫晶，葉青，趙敏，張詩琬，梅小平

川北醫學院附屬醫院，四川南充637000

2018 版歐洲肝病學會《慢性乙型肝炎病毒感染管理臨床實踐指南》及2019版《慢性乙型肝炎防治指南》［1］中均增加了血清HBV核心相關抗原（HBcrAg）、血清HBV RNA及乙肝病毒共價閉合環狀DNA這3種新型HBV感染與檢測的生物學標志物，其中HB‐crAg為一種混合型生物學標志物，由HBV前C/C區基因表達的幾種抗原共同構成。血清HBcrAg定量檢測與HBsAg的檢測結果互不重疊，血清中HBcrAg水平可部分反映HBeAg陽性患者肝細胞內HBV cccDNA的表達水平及轉錄活性，也可部分反映整合后的HBV DNA的轉錄活性與水平。HBV cccDNA的存在是HBV持續感染與復制的最直接生物學標志物［2-3］。目前，即使HBV感染相關患者血清中HBV DNA、HBsAg消失或發生血清學轉換，但肝細胞核中仍存在HBV cccDNA，肝細胞核內低表達的HBV cccDNA即可致HBV相關性肝病患者HBV復制、病情復發或肝細胞癌變的發生。由于HBV cccDNA存在于肝細胞內，需行創傷性肝組織穿刺活檢，且HBV cccDNA在肝內呈不均勻分布，因此HBV cccDNA的精準檢測難以在臨床上廣泛開展，但臨床上亟需尋找新型血清生物學標志物來精準反映肝組織內HBV cccDNA的表達水平及HBV轉錄程度與活性，其中HBcrAg、HBVpgRNA等表達水平可較好反映肝內HBV cccDNA的存在狀態與復制水平，具有廣泛的臨床應用價值，但血清HBcrAg檢測方法尚未標準化，可能與其在血清中低水平表達及相關研究數據少和尚未形成統一檢測標準等相關［4］。近年，隨著對HBcrAg研究的深入，血清HB‐crAg在HBV相關性肝臟疾病中的臨床應用情況取得一些研究進展，現綜述如下。

1 血清HBcrAg的構成與檢測方法

1.1 血清HBcrAg的構成HBcrAg作為HBV感染的血清生物學標志物之一，由HBeAg、HBcAg及核心相關蛋白（p22cr）構成，共享149個由C基因編碼的氨基酸編碼［4］。P22是由28～150氨基酸編碼構成的一種前核心蛋白，由前C/C基因區編碼和轉錄，表達于空缺的、無病毒核心的病毒顆粒中。P22多表達于HBV DNA陰性的病毒顆粒中且與HBV DNA構型無關。HBcAg、HBeAg及p22cr均為前C/C區的編碼產物。HBV進入肝細胞內并在肝細胞核中形成穩定的HBV cccDNA后，HBV轉錄成多種相關mRNA并編錄各種結構和非結構蛋白。HBcAg是HBV衣殼的主要結構蛋白質，在完整的HBV Dane顆粒中表達。HBeAg作為一種非結構性HBV蛋白，是HBV前C區N端加工后的代謝產物，p22cr與HBeAg一樣，也是前C區N端加工后的代謝產物，在HBV DNA陰性和HBcAg缺乏的Dane樣顆粒中均可檢出。

1.2 血清HBcrAg的檢測HBcrAg主要通過化學發光酶聯免疫法檢測［5］。因HBcAg、HBeAg和p22cr具有相同的氨基酸編碼，故采用同一株單克隆抗體即可檢出這3種標志物，檢測HBcrAg時也就檢出了由HBV RNA前C/C基因區轉錄的HBcAg、HBeAg與p22crAg三種 蛋白 抗原 水 平。HBcAg與p22crAg在血清中分別與相應的抗體結合形成抗原抗體復合物，HBcAg與p22crAg表達于HBV構型中，在同一單克隆抗體不易測出。HBcrAg檢測時，血清樣本需經預處理后使HBeAg和HBcAg與抗-HBe和抗-HBc所形成的抗原-抗體復合物中游離出來，解離HBeAg和HBcAg抗原的立體結構成直線狀態，并呈現出其游離狀態，此時再使用同一單克隆抗體后即可檢測［6］。主要通過血清標本與抗HBcrAg包被的微孔板混合成抗原—抗體免疫復合物，再用堿性磷酸酶標記后的抗HBcrAg來結合微孔板上的免疫復合物并形成抗原—抗體—酶標復合物，通過測定樣品中復合物的發光強度即可檢測血清HBcrAg水平。對于高濃度的HBcrAg可通過稀釋樣品來檢測，在抗HBc或抗HBe陽性樣本中也可精確地檢出HBeAg和HBcAg的表達水平，HBcrAg檢出的精度與HBeAg的表達模式及是否有HBeAg陰性及核前區突變無關［7］。HBcrAg定量檢測與HBsAg的檢測結果不重疊，血清中HBcrAg水平可部分反映肝細胞內cccDNA的表達水平及轉錄活性，也可反映整合后的HBV DNA的轉錄活性及復制狀態。

2 HBV相關性肝臟疾病患者中血清HBcrAg檢測的臨床應用

2.1 預測HBV相關性肝臟疾病患者肝組織中HBV cccDNA水平有研究發現，CHB患者循環血清中HBcrAg水平與肝內HBV cccDNA表達水平關系密切（r=0.929，P＜0.001），結果顯示，肝內HBV cccDNA表達水平及變化與循環血清HBsAg和HBcrAg水平變化相一致，初步認為，循環血清HBcrAg水平與肝細胞內HBVcccDNA水平的正相關性較血清HBsAg或HBV DNA更強［8-9］。研究發現，對CHB患者循環血HBcrAg、HBV RNA和HBsAg與肝組織內HBV cccDNA表達水平比較，HBeAg（+）患者循環血清中HBcrAg水平與HBsAg和HBV RNA水平均正相關，其HBV RNA水平與HBsAg水平亦呈正相關；對于HBeAg（-）患者循環血清中HBcrAg、HBsAg與HBV RNA間無相關性。多因素線性回歸分析顯示，對于HBeAg（+）的CHB患者，其血清中HBcrAg、HBsAg和HBV RNA均 與HBV cccDNA表達水平顯著相關；而HBeAg（-）患者血清中HBcrAg與HBV cccDNA水平顯著相關［10］。提示CHB患者血清HBcrAg水平較HBsAg、HBV RNA能更好地反映HBV cccDNA的表達水平，與HBeAg的表達模式無相關性。筆者認為，檢測循環血中HBcrAg表達水平可較好地反映HBV cccDNA的存在狀態與復制水平，這有利于評估抗HBV治療后停藥時機及療效的選擇。

研究發現，肝內cccDNA與肝內總HBV DNA的相關性最強（r=0.83，P＜0.0001），CHB患者血清中HBcrAg、HBV DNA與HBV cccDNA的相關性較好（r均=0.70，P＜0.0001），血清HBsAg水平與cccDNA的相關性較弱（r=0.40，P＜0.0001）［11］。作者認為，血清HBV DNA并不能完全真實地反映HBV cccDNA表達水平。理論上認為HBsAg是反映HBV活性和肝內HBV cccDNA水平的血清生物學標志物，但對于采用核苷（酸）類似物治療的CHB患者，即使HBV DNA低于檢測下線后但HBsAg水平仍可檢出且可高表達，在肝內HBV cccDNA還可檢出或高表達，提示HBsAg與cccDNA的相關性較弱［12］，這可能與HBV復制的低水平或存在與循環血中空HBsAg顆粒的高表達相關，進一步研究也顯示HBsAg與HBV cccDNA的相關性較差。作者認為，血清HB‐sAg與HBV cccDNA相關性相對性較差而不是一個理想反映HBV cccDNA水平的替代生物學指標，而循環血中的HBcrAg表達水平可較好地反映HBV cccDNA存在狀態與復制水平。

2.2 預測HBV相關性肝臟疾病患者HBeAg血清學轉換HBV感染后獲得免疫調控的結果之一是由HBeAg（+）轉化為HBeAg（-），即血清學轉換，一旦發生HBeAg（-）變化，提示HBV感染的相關疾病患者發生HCC風險可能性下調。部分HBV感染的相關疾病患者，未經抗HBV治療也能出現HBeAg血清學轉換，但多數HBV感染的相關肝病患者還是需抗HBV治療后才能呈現HBeAg的血清學轉換。

觀察HBV感染的相關肝病患者血清HBcrAg水平表達對患者病情與病程監測有指導作用［9］。有研究結果顯示，HBeAg（+）慢性肝炎或慢性感染者循環血清HBcrAg表達水平較HBeAg（-）的CHB或慢性感染者高表達，提示HBcrAg表達水平與HBeAg的表達模式有明顯的相關性，作者認為，患者血清HB‐crAg可在一定程度上區分CHB/慢性感染者HBeAg的表達模式［13-15］。研究發現，對HBeAg（+）CHB患者行6個月的PEG-IFN治療后發現，有9例患者在停用IFNα治療后的隨訪中出現HBeAg血清學轉換，其循環血清HBcrAg水平在治療結束后仍持續性下調，但循環血清HBsAg水平下調持續時間短、下調幅度不明顯［7］，另外，在PEG-IFNα治療1個月時循環血清中HBcrAg水平下調幅度可較好預測治療停藥時的HBeAg血清學轉換的發生概率。研究發現，血清HBcrAg可有效預測CHB患者抗HBV治療后的HBeAg血清學轉換概率［8］。

2.3 判斷HBV相關性肝臟疾病臨床治愈的終點HBsAg是HBV顆粒的外膜蛋白，HBV復制是以肝細胞核中HBV cccDNA為模板合成新的HBV基因，同時參與HBV復制、轉錄所需蛋白的合成。在HBV基因組中S、preS1和preS2區合成了小、中、大3種分子的蛋白質并構成HBV顆粒的包膜，小、中、大3種分子的蛋白質通過形成完整病毒顆粒（Dane顆粒）或管狀或球狀亞病毒顆粒模式分泌出來，即循環血清中的HBsAg蛋白質，在免疫抑制中發揮誘導作用而使HBV存在于體內、并不斷感染新的肝細胞［16］，其高水平的HBsAg為診斷HBV感染的生物學標志物之一［17］。

研究發現，在抗HBV治療中，HBsAg（-）提示其為抗HBV治療終點的生物學指標之一，治療結束后患者復發率較低［18］，在對CHB患者抗HBV治療中出現HBsAg（-），停藥40.2個月后的隨訪中出現復發的占4.5%［19］。接受恩替卡韋（ETV）治療的CHB患者在達到停藥標準后再鞏固治療1年及以上，在停藥 后6、12和24個 月 時，28例HBsAg水平＞3 lgIU/mL的CHB患者停藥后復發率為15.4%、55.7%和83.4%［20］；11例HBsAg水 平 為＞2～3 lgIU/mL的CHB患者停藥時復發率為18.2%、28.4%和28.4%，該研究結果顯示，HBsAg的血清學轉換與表達是CHB患者抗HBV治療終點的標志物之一，對CHB患者抗HBV治療終點時機選擇與復發預測有一定的指導作用。研究發現，CHB患者血清HBsAg表達水平與肝組織內HBV cccDNA的相關性弱，這可能與部分CHB患者血清HBsAg（-）而其肝組織中HBV cccDNA仍表達相關［8］，與部分學者研究的血清HBsAg水平與肝組織內HBV cccD‐NA無明顯相關性的結果相一致，提示血清HBsAg水平不能完全反映肝組織內HBV cccDNA的水平。另外，HBV cccDNA在被清除或沉默時，其血清HB‐sAg仍可低水平表達，這可能與HBsAg蛋白合成多途徑相關，同時血清中HBsAg多在無HBV DNA表達的小球型、管狀顆粒中表達，但也可表達于Dane顆粒包膜上，HBsAg主要在小球型、管狀顆粒中表達，血清中HBsAg多來自肝細胞核內HBV cccD‐NA，提示整合的HBV DNA片段也可轉錄HB‐sAg［21-22］。作者認為，以HBsAg表達水平或血清學轉化來作為CHB臨床治愈的判斷終點存在一定的局限性，如聯合血清HBcrAg水平來共同判斷抗HBV治療CHB患者臨床治療終點及停藥后復發風險可能意義更大。

2.4 選擇抗HBV治療停藥時機、預測HBV是否復發目前關于CHB患者抗HBV治療公認的治療終點是HBsAg消失或血清學轉換，在臨床治療過程中要達到此標準較為困難。對于部分HBsAg（+）的CHB患者，會因各種原因需考慮停藥，但停藥后存在HBV復制或再復制、肝組織炎癥發生及肝細胞惡變等問題。目前認為CHB患者停用抗HBV藥物后能否再出現HBV復制、肝組織炎癥或肝細胞惡變的發生多與肝細胞內HBV cccDNA水平表達和患者機體對HBV特異性免疫清除能力這兩個因素有關。

殘存于肝細胞中HBV cccDNA的復制能力與其HBV水平、誘發因素、HBV復制的微環境形成及患者機體對HBV特異性免疫清除能力等因素相關。在機體誘發因素和HBV復制微環境等相對穩定狀態下，HBV cccDNA水平取決于HBV cccDNA的復制能力，為此了解肝組織內HBV cccDNA水平表達有利于抗HBV治療終止時機選擇及預測停藥后HBV再復制、肝組織炎癥再發生或肝細胞惡變的重要生物學指標。多數學者認為血清HBcrAg是反映肝內HBV cccDNA水平的較好替代血清生物學指標，其相關性與準確性優于血清HBV RNA和HB‐sAg水平，為此作者認為，血清HBcrAg可能是預測抗HBV治療停藥后是否復發的有效評估指標之一。

在日本的CHB診治指南中已將血清HBcrAg定量檢測推薦用于CHB患者抗HBV治療停藥時機選擇及病情復發評估的重要預測指標。研究發現，對于CHB患者在采用核苷（酸）類似物抗HBV治療2年以上時，在血清HBV DNA和HBeAg均（-）的條件下停藥與否還需通過HBcrAg和HBsAg水平評分來綜合預測、評估停藥后的復發風險［23］。在該評分系統中，停藥時需按血清HBcrAg水平高低評分，0分為HBcrAg＜3.0 logU/mL、1分 為HBcrAg在3.0～4.0 logU/mL間，2分為HBcrAg≥4.0 log U/mL。根據血清HBcrAg水平與評分總和將CHB患者停藥后復發風險分為3級，高風險組為3～4分，中風險組為1～2分，低風險組為0分。研究發現，低風險組停藥后復發風險率為10%～20%，可考慮停藥，但需警惕有復發風險，中風險組停藥后復發風險率約50%，高風險組停藥后復發風險率為80%～90%，對于中、高風險組患者建議持續治療，不宜停用抗HBV治療。

研究發現，對于血清HBsAg低水平的CHB患者其血清HBcrAg水平可出現高表達；同樣血清HBcrAg＜3 logU/mL的CHB患者其血清HBsAg水平也可出現高表達，為此，作者認為，僅據血清HBsAg或血清HBcrAg表達水平來選擇抗HBV治療的停藥時機或治療終點可能存在一定局限性。有研究發現，在對CHB患者采用核苷（酸）類似物抗HBV治療8年以上的研究結果顯示，其循環血中HBsAg和HBcrAg表達水平與抗HBV治療時間的延長呈正相關系，也就是說CHB患者血清HBsAg和HBcrAg表達水平在隨抗HBV治療時間的延長其水平呈現明顯下調趨勢［24-25］。據血清HBcrAg水平對CHB患者抗HBV治療停藥后復發風險評估發現，低、中、高風險組的復發風險分別為3.2%、34.0%和62.8%，這可能是血清HBsAg低水平或HBsAg血清學轉換后的CHB患者在停用抗HBV治療后短期內復發的原因，若同時檢測血清HBcrAg水平可能有助于避免盲目或因過早過遲停藥后不良現象的出現［26］。

2.5 預測HBV相關性肝臟疾病患者發生肝細胞癌變的概率HCC的發生與肝細胞受到持續與反復的炎癥刺激或HBV基因整合后的基因突變等因素相關，同時持續的HBV cccDNA存在或高表達是HCC發生的高危因素。在HCC患者中，其血清HB‐crAg與HBV cccDNA相關性較強，為此，作者認為CHB患者血清HBcrAg過表達可能與HCC的發生發展密切相關。

為了解血清HBcrAg水平與HCC發生發展的相關性，有研究發現，血清HBcrAg在預測HCC發生方面優于血清HBV DNA和HBeAg，其HBcrAg水平持續＞2.9 logU/mL是HCC發生的獨立預測因子［27］。有研究結果顯示，在對CHB患者采用核苷（酸）類似物治療后HBV DNA水平低于檢測下線時，與未發生HCC的CHB患者比較，治療前HCC患者HBcrAg水平高表達（5.45 logU/mL和4.55 logU/mL，P=0.005）；其治療前HBcrAg＞4.67 logU/mL和治療后HBcrAg＞3.89 log U/mL均 可 獨 立 預 測HCC的 發生［28］。另外，血清HBcrAg對HCC切除或射頻消融后的復發具有一定的預測價值。研究發現，對HBV相關性HCC患者行根治性切除或經皮消融術后再采用核苷（酸）類似物抗HBV治療的研究發現，若血清HBcrAg＞4.8 logU/mL在2年內HCC復發危險比為8.96［29］。此外，在對HBV相關性HCC患者采用核苷（酸）類似物抗HBV治療后，其血清中HBcrAg持續高表達者更易發展為HCC，HBeAg（-）后3年內有HBcrAg過表達是HCC發生發展的獨立相關因素［30］。研究發現，核苷（酸）類似物治療CHB患者后血清HBcrAg＞3.01gU/mL時，發生HCC的風險較高（HR=2.77），提示高水平血清HBcrAg與HCC發生顯著相關（HR=3.53），多變量分析發現，CHB患者血清HBcrAg＞2.91gU/mL（HR=5.09，95%可 信 區 間2.40～10.63）與HCC的發生顯著相關［31］。為此，作者認為，在預測CHB患者HCC發生風險方面，HB‐crAg較HBV DNA等血清學標志物優勢較為顯著，提示血清HBcrAg可能成為預測HBV相關性肝病患者HCC發生的可能潛在生物學標志物之一。作者認為，血清HBcrAg在預測HCC發生、腫瘤復發及抗HBV療效評價方面體現出明顯的臨床價值，盡可能將血清HBcrAg控制在最低水平以最大限度降低HBV水平對抑制HBV復發或降低HCC發生及術后HCC復發風險具有一定的潛在價值。

綜上所述，HBcrAg、HBV RNA等一些新的潛在生物學指標能在一定程度上可預測肝內cccDNA的存在與轉錄狀態、預測HBV相關性肝臟疾病HBeAg血清學轉換、反映HBV RNA、HBV DNA、HBsAg水平，同時在預測CHB患者病情狀況、評估療效、選擇停藥時機及預測停藥后復發風險等方面具有較高的臨床價值。但目前血清HBcrAg檢測技術尚未成熟，仍處于探索階段，如血清HBcrAg是否能準確地反映HBV cccDNA的存在狀態，HBcrAg作為停藥終點指標的價值是否優于HBsAg等問題尚待解決。