河南省某肉牛屠宰場牛支原體感染情況調查

（河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，鄭州 450002）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種主要的、但通常被忽視的病原體，它屬于柔膜體綱，是以缺乏細胞壁、最小的、能自我復制為特征的微生物。主要引起牛的肺炎、關節炎、乳房炎、角膜結膜炎、生殖道炎癥以及流產和不孕等疾病，對全世界的養牛業構成了主要威脅[1,2]。在中國，自2008年以來，該病原體已被證明對牛的健康構成威脅，大約10%的致死率主要是由牛支原體引起的肺炎，到目前為止，還沒有有效的疫苗來阻止牛支原體的感染。與此同時，由于細菌耐藥性的增強，抗生素治療正在降低其有效性，使得它的控制變得難以實現和困難[3,4]。鑒于此，本研究從河南省肉牛屠宰場中采集病料進行了牛支原體分離鑒定，旨在對河南省牛支原體的流行病學進行調查，為牛支原體的診斷、疫苗的研制開發以及牛支原體病的綜合防治奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 病料與毒株

于2019年12月，從河南省某肉牛屠宰場采集肺等病料共計320份。樣品低溫運送至實驗室。牛支原體HB0801株，由華中農業大學郭愛珍教授惠贈。

1．2 主要試劑

PPLO肉湯粉、TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆瓊脂），購自BD有限公司；酵母粉、瓊脂粉，購自美國BD公司；葡萄糖、酚紅，購自上海國藥集團公司；MEM、馬血清，購自Hyclone公司；青霉素，購自華北制藥集團公司；精氨酸，購自Roche公司；2×Direct PCR Mix、Hot Start Taq酶、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1．3 培養基的配制

PPLO液體培養基：PPLO肉湯粉10.5g、葡萄糖2.5g、酵母粉2.5g，溶于440mL超純水中，115℃滅菌15min，加MEM 5mL、馬血清50mL、8萬單位青霉素5mL、10%精氨酸10mL和1% 酚紅500μL。PPLO固體培養基：含1.5% 瓊脂粉的PPLO液體培養基。培養基于115℃滅菌15min后，于4℃保存備用。

1．4 引物的設計

根據GenBank中牛支原體16S rRNA基因設計1對通用引物，用于牛支原體的擴增。上游引物P1：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，下游引物P2：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’， 預計擴增目的片段1 390bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1．5 牛支原體的分離培養

將無菌條件下采集的肺組織切成小塊，加入2mL PBS，碾磨后將上清以5 000r/min離心3min，然后用0.45μm濾膜過濾，加入到有酚紅的PPLO液體培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。3～5d后，轉接至PPLO液體培養基傳代，直至液體顏色由紅色變為黃色，取100μL涂布PPLO固體培養基表面，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。3～5d后，肉眼觀察生長情況并在低倍顯微鏡下觀察固體培養基上菌落的形態，吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態。

1．6 牛支原體的鑒定

將疑似支原體菌落接種PPLO液體培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中培養3d。培養基由紅色變為黃色時，收集菌體，用DNA提取試劑盒提取DNA，分別用P1、P2擴增并測序鑒定。以牛支原體HB0801株為陽性對照。

2 結果與分析

2．1 牛支原體的分離培養

肺組織培養3～5d、傳代1～3代后，PPLO液體培養基逐漸變黃，PPLO平板上肉眼可見極小的針尖狀菌落，低倍顯微鏡下觀察固體培養基上菌落的形態，為多樣并有典型的支原體“煎荷包蛋樣”（圖1）。吉姆薩染色，油鏡下觀察支原體菌體形態，為多形態，呈球菌樣、彎曲的絲狀、螺旋狀（圖2）。320份病料中形態上疑似為牛支原體的共計97株。

圖1 牛支原體菌落顯微鏡下形態

圖2 牛支原體菌體吉姆薩染色顯微鏡下形態

2．2 牛支原體的PCR鑒定結果

將97株疑似牛支原體菌體提取DNA擴增，經測序有15株與牛支原體 HB0801-P180株（GenBank No：CP007591）同源性在98%以上。證明所分離的15株毒株為牛支原體，其余經鑒定均為無膽甾原體或精氨酸支原體等。

圖3 牛支原體PCR鑒定結果

結合以上結果，共從320份病料中分離鑒定出15株牛支原體，分離率達4.68%。

3 結論與討論

本試驗于2019年12月在河南省某肉牛屠宰場采集肺等樣品共計320份，分離出疑似支原體97株，鑒定結果有15株為牛支原體。

由于牛支原體與其他支原體和無膽甾原體形態上非常相似，難以區分，故在進行支原體培養時，分離出97株形態類似的菌體，通過測序比對，發現大多為無膽甾原體、精氨酸支原體等。這些不致病的病原在形態上與牛支原體很難區分，只有通過測序才能將其鑒定出，最后從320份樣品中分離鑒定出15株牛支原體。在屠宰場中看似健康的成年肉牛感染率也是較高的，有相當一部分肺臟樣品表現不同程度的肉樣實變。因此，分離的病原均為牛支原體，而不是絲狀支原體或其他支原體。

2008年以來我國多數地區均報道有牛支原體的感染情況[5～12]，而河南省牛支原體的報道相對較少[13～15]，本研究對河南省肉牛屠宰場的支原體進行了分離鑒定，從結果看，河南省牛支原體在屠宰場的感染情況十分嚴重，陽性率高達4.68%。對屠宰場牛支原體的感染應當引起足夠的重視。應加強屠宰場的管理和檢疫，以防止本病的擴散和蔓延。