甘肅省武威市涼州區奶牛病毒性腹瀉病毒的流行病學調查與分析

王衡，滿海燕

（1.甘肅省武威市涼州區永昌鎮畜牧獸醫服務站，武威 733000；2.甘肅省武威市涼州區農產品質量安全監督管理站，武威 733000）

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的牛的一種以腹瀉、胃腸炎、消化道黏膜糜爛及壞死為主要特征的接觸性傳染病[1,2]，BVDV進入機體后會破壞牛的自身免疫系統，使機體處于免疫耐受和持續感染狀態，導致免疫力下降，使病牛容易被致病菌侵襲而感染其他疾病[3,4]。由于牛群中BVDV持續感染的長期存在，只有通過流行病學監測并逐步淘汰持續帶毒感染牛才能達到有效控制[5]。BVDV于1946年在美國紐約州被首次報道，隨后呈全球范圍內流行，目前已有部分發達國家宣稱其已徹底消滅凈化了BVDV，我國于1980年在吉林省某奶牛場一頭突發高燒，腸道嚴重出血、糜爛和潰瘍的高產奶牛中首次分離到BVDV[6]。近年來，隨著我國奶牛養殖業的飛速發展，國外引種以及各地區之間貿易交流的日益頻繁，BVDV傳播風險逐步升高，BVDV感染已在一定程度上直接影響我國奶牛養殖業的可持續發展。為了掌握甘肅省武威市涼州區奶牛群中BVDV的流行情況，有效保護甘肅省奶牛養殖產業的健康發展，本研究采用RT-PCR方法對2017-2019年采集于甘肅省武威市涼州區的690份奶牛糞便樣品進行了BVDV的流行病學調查與分析。

1 材料與方法

1．1 檢測樣品來源

2017～2019年，采集于甘肅省武威市涼州區奶牛不同養殖場及散養戶的奶牛新鮮糞便樣品共計690份，其中臨床中具有明顯腹瀉癥狀的腹瀉奶牛糞便樣品243份，臨床中沒有表現出腹瀉癥狀的牛只糞便樣品447份。

1．2 主要試劑

病毒基因組RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR擴增試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1．3 糞便樣品的處理與病毒基因組RNA的提取

將采集的新鮮糞便樣品溶解于5倍體積滅菌生理鹽水中，充分破碎、混合均勻后，以12 000r/min離心10min，吸取上清液0.2mL，利用病毒基因組RNA提取試劑盒依次提取690份糞便樣品的病毒基因組RNA。

1．4 引物設計與合成

參照參考文獻[7]的方法，設計1對BVDV特異性檢測引物，上游引物序列為：5’-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3’，下游引物序列為：5’-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3’，該引物預擴增244bp的BVDV 5’端非編碼區基因保守序列。

1．5 RT-PCR擴增與檢測

利用合成的BVDV特異性檢測引物分別對提取的690份糞便樣品病毒基因組RNA進行一步法RT-PCR擴增。RT-PCR擴增體系為：2×Buffer 10μL、BVDV上游和下游引物各0.5μL、酶0.5μL、RNA 3.0μL、水5.5μL；RT-PCR擴增程序為：50℃ 30min；95℃3min；95℃ 20s，56℃ 20s，72℃ 20s，共35個循環；72℃ 8min。RT-PCR擴增結束后，取5μ L擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1．6 檢測結果的比較分析

將690份檢測樣品的RT-PCR擴增結果依次進行不同年份下腹瀉患牛糞便樣品和無腹瀉癥狀糞便樣品的比較分析，掌握甘肅省武威市涼州區2017～2019年腹瀉奶牛和健康奶牛BVDV的感染情況。

2 結果與分析

2．1 RT-PCR擴增結果

采用RT-PCR方法對采集于甘肅省武威市涼州區的690份糞便樣品進行了BVDV的病原學檢測，共檢測出BVDV陽性樣品114份，BVDV陰性樣品576份，部分樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

圖1 部分樣品RT-PCR擴增結果

2．2 不同年份下總體樣品的檢測結果

表1為不同年份下690份奶牛糞便樣品的總體檢測結果。從表1可以看出，2017-2019年BVDV總體陽性感染率為16.52%，其中2017年、2018年、2019年的陽性感染率分別為12.50%、16.25%、19.77%，甘肅省武威市涼州區奶牛群中BVDV的陽性感染率呈現出逐年升高的趨勢。

表1 不同年份下總體樣品的檢測結果 單位：份,%

2．3 不同年份下腹瀉奶牛樣品的檢測結果

表2為不同年份下243份腹瀉奶牛糞便樣品的檢測結果。從表2可以看出，2017-2019年腹瀉奶牛中BVDV總體陽性感染率為35.80%，其中2017年、2018年、2019年的陽性感染率分別為28.57%、34.48%、41.94%，腹瀉奶牛中BVDV的陽性感染率呈現出逐年升高的趨勢。

表2 不同年份下腹瀉奶牛樣品的檢測結果 單位：份,%

2．4 不同年份下健康奶牛樣品的檢測結果

表3為不同年份下447份無腹瀉癥狀奶牛糞便樣品的檢測結果。從表3可以看出，2017-2019年這些奶牛中BVDV總體陽性感染率為6.04%，其中2017年、2018年、2019年的陽性感染率分別為4.65%、5.88%、7.27%，無腹瀉癥狀奶牛BVDV的陽性感染率呈現出逐年升高的趨勢。

表3 不同年份下無腹瀉癥狀奶牛樣品的檢測結果 單位：份,%

3 討論

BVDV一直是引起奶牛相關腹瀉性疾病的主要致病原之一，近年來隨著我國奶牛養殖產業的不斷擴大，BVDV在奶牛群中的流行也日漸擴大，給我國奶牛養殖業帶來了巨大威脅，當前我國奶牛養殖業比較密集的地區均陸續報道了BVDV的感染。商云鵬等[8]采用RT-PCR方法對采集于東北地區19個規模化奶牛場的血清樣品進行了BVDV的病原學檢測，結果顯示有52.6%（10/19）的奶牛場檢測出BVDV核酸陽性，東北地區大部分奶牛場中存在BVDV感染，且存在BVDV持續性感染牛。張世勛等[9]采用RT-PCR方法對黑龍江省4個規模化奶牛場（A～D場）奶牛耳組織樣品進行了BVDV抗原檢測，結果A場、B場、C場、D場奶牛BVDV陽性率分別為0.5%（1/193）、0.2%（2/875）、1.8%（1/55）、0%（0/163），表明黑龍江省部分地區奶牛群中存在BVDV污染。張信軍等[10]采用巢式RT-PCR方法對江蘇省7個市和地區的13個大型規模化奶牛養殖場的100份血清樣品進行BVDV抗原檢測與基因分型，結果BVDV平均陽性感染率為55%（55/100），BVDV-Ⅰ型占11%（6/55），BVDV-Ⅱ型為78%（43/55），Ⅰ型與Ⅱ型混合感染占11%（6/55），表明BVDV在江蘇省主要規模奶牛場普遍流行，且大部分牛場均能檢測到BVDV持續感染牛。該BVDV感染的基因型包括基因Ⅰ型、Ⅱ型，但主要以Ⅱ型為主。本研究采用RT-PCR方法對2017～2019年采集于甘肅武威市涼州區的690份奶牛糞便樣品（腹瀉奶牛糞便樣品243份，無腹瀉癥狀奶牛糞便樣品447份）進行了BVDV的病原學檢測與分析，BVDV總體陽性感染率為16.52%（114/690），腹瀉奶牛陽性感染率為35.80%（87/243），無腹瀉癥狀奶牛陽性感染率為6.04%（27/447）。以上不同地區的流行病學調查資料共同表明，包括甘肅省武威市涼州區在內的我國奶牛養殖密集地區均存在BVDV的感染與流行，且不同地區的陽性感染率差異較大。同時，本次流行病學調查中發現甘肅省武威市涼州區奶牛群中BVDV的陽性感染率自2017-2019年有逐年升高的趨勢，雖然升高的幅度并不是很大，但仍存在BVDV流行逐漸嚴重的勢頭，應引起足夠重視，需要加強奶牛群中BVDV的綜合防控工作。對于奶牛BVDV的綜合防控，應采取以疫苗免疫接種為主，加強流行病學監測，根據流行病學監測結果逐步撲殺、淘汰陽性感染牛，早日實現奶牛群中BVDV的凈化。