新生小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離方法

國敏，郝佳琳，朱慶鋒，李丹妮，李小曼

（中國醫科大學 1.轉化醫學研究院，沈陽 110122；2.附屬第一醫院腫瘤內科，沈陽 110001）

肺泡上皮細胞包括Ⅰ型和Ⅱ型細胞，肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡ epithelial cell，AECⅡ）的數量較肺泡Ⅰ型上皮細胞多，占肺泡上皮細胞的60 %，但其體積較小，僅覆蓋肺泡表面的5 %［1-2］。AECⅡ可以合成、儲存并分泌肺表面活性物質（pulmonarysurfactant，PS）和相關蛋白，從而降低肺泡表面張力，增加肺的順應性，維持大小肺泡容積的相對穩定，防止肺不張和肺水腫。近年來，有關AECⅡ的研究［3-4］在國內外已受到高度重視，其與許多肺部疾病的發生發展息息相關，PS的變異是引起新生兒急性呼吸窘迫綜合征的重要因素［5-6］。然而，目前缺乏理想的細胞模型，研究出簡單、高效、高純度的方法尤為重要。本研究首次以新生24 h內的小鼠為研究對象，提出一種分離培養原代AECⅡ的新方法，為今后有關肺部疾病的研究提供了較好的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

DPBS（不含 Ca2+和Mg2+）、Dispase、胎牛血清（美國Gibco公司）；DNA酶 Ⅰ、Mouse IgG（美國Sigma公司）；DMEM培養基（中國BI公司）；免疫磁珠、Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔抗體（美國Invitrogen公司）；表面活性蛋白-A（surfactant protein A，SP-A抗體）、表面活性蛋白-B（surfactant protein B，SP-B）抗體、表面活性蛋白-C前體（prosurfactant protein C，proSP-C）抗體（美國Millipore公司）；生物素化的CD45、CD16/CD32和 Ter119抗體（美國BD公司）；纖連蛋白（中國Corning公司）；高速冷凍離心機（美國Thermo scientific公司）；正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 單細胞懸浮液的制備：將一對 C57B/L6雌雄小鼠合籠21 d左右，取出生24 h內的新生小鼠。75%乙醇擦拭新生小鼠腹部皮膚，尖頭鑷子破開幼鼠腹部，棄掉腹腔臟器，夾斷腎動脈，暴露出心臟與肺部。將無菌胰島素注射器插入心臟右心室，注入1～2 mL DPBS，直到視覺上肺部變白。……