柿屬新種德陽柿組培快繁技術研究

王洋　邱曉　孫海蓮　常虹　徐莉清

摘要 為了使德陽柿能夠通過組織培養的方式在短期內快速繁殖，探究德陽柿培養基的最適培養條件。取一年生德陽柿枝條上的休眠芽莖段無菌處理后作為外植體，選擇不同的基本培養基，對德陽柿組培快繁技術進行研究。結果表明，以MS 為基本培養基的德陽柿休眠芽組培苗萌發率達81.13%，以MS（1/2N）為基本培養基的德陽柿休眠芽萌發率為78.05%;德陽柿誘導休眠芽以MS（1/2N）為基本培養基的長勢要優于以MS 為基本培養基。由此可知，MS（1/2N）培養基是德陽柿幼芽初代培養的最適培養基。該研究提供了德陽柿初代培養的最適培養基，為其短期內大量繁殖提供了技術指導和理論支持。

關鍵詞 德陽柿;組培快繁;初代培養;繼代培養;無菌操作;接種;育苗

中圖分類號 S665.2文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）22-0051-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.015

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Persimmon from Deyang， a New Species of Persimmon

WANG? Yang1，2，3，? QIU? Xiao1，2， SUN Hai-lian1，2? et al

（1.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Hohhot，Inner Mongolia 010031;2.Inner Mongolia Prataculture Research Center， Chinese Academy of Sciences，Hohhot，Inner Mongolia 010031;3.Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract In order to make Deyang persimmon multiply rapidly in a short time by tissue culture， the optimum culture conditions of Deyang persimmon were studied. The stem segment of dormant buds on the branches of deyang persimmon was treated asepsis and used as explants. The germination rate of the dormant buds in Deyang persimmon using MS as the basic medium was 81.13%， while the germination rate of the dormant buds in Deyang persimmon using MS（1/2 n） as the basic medium was 78.05%. The growth rate of the dormant buds in Deyang persimmon with MS（1/2 n） as the basic medium was better than that with MS as the basic medium. Finally， it can be concluded that MS（1/2 n） medium was the optimal medium for the primary bud culture of deyang persimmon. This study provided the optimum medium for the primary culture of Deyang persimmon and provided technical guidance and theoretical support for its short-term mass reproduction.

Key words Deyang persimmon;Tissue culture and rapid propagation;Primary culture;Subculture;Aseptic operation;Vaccination;Seedling

作者簡介 王洋（1996—），女，內蒙古呼和浩特人，研究實習員，從事草業科學研究。*通信作者，高級工程師，從事種質資源研究。

收稿日期 2020-03-24

德陽柿（Diospyros sp.Deyangshi;2n=4x=60），又稱紅花野毛柿，為雌雄異株的落葉果樹，主要產自四川省德陽市，是2007年國家柿種質資源圃從四川德陽采集的野生資源。且利用德陽柿的種子播種后長出的實生苗，第二年就能開花[1]。因其具有早花等特性，成為學術界關注的熱點問題[2]。

張永芳[3]利用掃描電鏡對其進行孢粉學觀察和SRAP分子標記分析，將其確定為柿屬的一個新品種，并證實為四倍體基因型。發現該品種柿屬植物的早花特性在研究果樹植物遺傳轉化方面具有巨大的應用潛力。但開展植物基因工程技術是德陽柿得以更廣泛應用的前提，其關鍵應用前提是建立德陽柿較好的再生體系[4]。轉基因技術研究的前提是建立高效穩定的遺傳轉化受體系統。

關于柿的初代組織培養技術，國內外已有學者進行了相關方面的研究[5]。研究發現甜柿上西早生葉片適合在低礦物質元素，尤其是較低氮素含量的培養基中增殖與生長[6]。君遷子休眠芽初代培養中，DKW培養基最適合其生長發育[7]。以磨盤柿4月中旬生長中的幼芽和8月下旬休眠芽為外植體研究發現，高濃度ZT不利于柿的初代培養[8]。研究發現基本培養基DKW對磨盤柿的繼代增殖效果最好[9]，且在ZT（1.0～2.0 mg/L）和IAA（0.1 mg/L）的激素配比條件下，磨盤柿繼代苗的分化和長勢最好[10]。研究表明柿組培苗根尖的有無與不定芽的再生效果無關，而根段長度與不定芽再生效率呈極顯著正相關[11]。

德陽柿是一個四倍體柿屬新種[12]，具有早花特性，是柿基因工程研究的理想材料[13]。但目前國內外尚未見關于德陽柿高效、穩定的植株再生體系的研究，在一定程度上限制了對德陽柿使用基因工程技術研究[14]。因柿組織培養方法品種間差異較大，且含酚類物質較多，建立完整的組培快繁體系較困難[15]，不同品種之間最適培養基的成分配比不完全相同，該試驗設計原理將參照現有的柿屬植物組織培養研究成果，進一步探究德陽柿這一特定品種的培養基成分最佳配比。筆者以德陽柿休眠芽為外植體，比較組培過程中的各種因素，篩選出最適的生長發育與再生培養條件，建立德陽柿組織培養體系，為后續遺傳轉化研究提供試驗材料，為德陽柿基因轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為德陽柿（Diospyros sp.Deyangshi），為華中農業大學柿基因庫2015年長勢良好的成年樹。

1.2 3種不同培養基的篩選

1.2.1 外植體接種前處理。

取一年生德陽柿枝條上的休眠芽，剝去芽外側的2～3個鱗片，用清水淋洗45 min，去除表面灰塵和細菌，再將生長狀況良好的芽用刀片切下，用75%乙醇表面消毒30 s，再用2%的次氯酸鈉浸泡消毒4 min，在浸泡過程中要不斷搖動，最后用無菌水沖洗5次，每次5 min。

1.2.2 不同基本培養基配制。基本培養基有3種：MS（1/2N）培養基、MS培養基、DKW培養基。所有的基本培養基中均含有蔗糖30.0 mg/L，瓊脂6.0 mg/L，PVP-K40 0.6 mg/L，ZT 0.5 mg/L，IAA 0.01 mg/L，pH為5.8。基本培養基配制好后，于121 ℃高溫滅菌15 min，然后置于超凈工作臺中冷卻至55 ℃左右，搖勻后分裝至培養瓶中。

1.2.3 接種。

將休眠芽用75%乙醇進行表面滅菌30 s，再用2%的NaClO浸泡10～15 min。將清洗后的休眠芽剝去外鱗片，留莖尖約1.5 mm，保留2～3片葉原，接種到相應的初代培養基上，每個組合接種20個，重復3次，置于25 ℃、3 000 lx光強、16 h/d光照的人工培養室培養。

1.3 初代培養最適氮含量的探究

根據上述試驗可得，MS培養基和（1/2N）MS培養基對于德陽柿休眠芽的初代培養較為適宜，且成活率相差不大，但氮元素的含量對于植株的形態構成有一定的影響。氮元素是構成蛋白質的主要成分，通過影響基因的轉錄和表達改變植株的形態，氮元素缺乏時，植株矮小，葉片黃化，成熟后果實品質差，坐果率低，嚴重影響果實的產量，而氮元素過多時，植株徒長，抗逆性差，后期果實含糖量較低，發育緩慢。因此，植株培育初期要嚴格控制培養基中的氮元素含量，并以此為依據進行德陽柿休眠芽初代培養最適氮含量的探究（表1）。根據前述試驗可得，最適氮元素含量在MS培養基氮元素含量與（1/2N）MS培養基氮元素含量之間。

根據MS培養基配方可以看出，MS培養基與（1/2N）MS培養基中氮元素的差別在于（1/2N）MS培養基中KNO3和NH4NO3的成分是否減半，因此，將通過設計KNO3和NH4NO3的濃度梯度來探究德陽柿休眠芽初代培養基中最適氮元素的含量（表2）。

1.4 葉片愈傷組織培養最適激素含量的探究

1.4.1 外植體接種前處理。

采摘德陽柿當年新梢，留頂端3～4片葉片，取下面所有葉片，用流水沖洗 30～60 min，然后放入已經滅菌好的錐形瓶中，用75%乙醇進行表面滅菌30 s，再用2%NaClO浸泡3～4 min，浸泡過程要不斷搖動，最后用無菌水沖洗4～5次。在無菌條件下，留頂端3～4片葉片，取下面所有葉片，將葉片橫切成4 mm×4 mm大小，接種到配制好的10種培養基上，培養基以 MS（1/2N）為基本培養基，添加的激素濃度按表3設計。每個處理接種50片，先暗處

理20 d，統計葉片愈傷組織形成率（利用倫理數值），將誘導出的愈傷組織接種到MS（1/2N）+PVP 0.6 mg/L+ZT 1 mg/L+IAA 0.1 mg/L 培養基中轉至正常光照下培養。30 d后分別統計分化率、平均不定芽數。

葉片接種培養基：MS（1/2N）+PVP 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L +蔗糖 20 g/L+ 瓊脂 7.5 g/L，pH=5.8。

1.4.2 不同激素含量的配制。

試驗設計見表3，柿屬植物葉片愈傷組織誘導的最適TDZ濃度為0.01～0.10 mg/L，最適NAA濃度為0～0.2 mg/L[7]，因此，以華中農業大學柿屬植物資源庫樹齡2年的德陽柿春季葉片為外植體，以（1/2N）MS培養基為基本培養基，每組激素組合接種葉片切塊50片，探究德陽柿葉片愈傷組織培養的最適TDZ和NAA濃度。外植體葉片在培養基中培養10 d后開始生長，20 d后出現嫩綠色的愈傷組織。

1.5 數據分析

試驗數據均采用SPSS 20.0 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 3種不同培養基的篩選

德陽柿休眠芽的無菌莖段接入初代培養基15 d后開始萌發，30 d左右，休眠芽發育為2～3 cm（30 d為一個觀察周期）。

MS培養基的萌發率為8113%，長勢狀況一般，休眠芽在培養基中萌發速度較快，葉片較MS（1/2N）培養基黃化嚴重、稀疏，葉片偏黃且卷曲嚴重，植株細弱;MS（1/2N）培養基的萌發率為78.05%，長勢狀況良好，休眠芽在培養基中萌發快，葉展開幅度大，且濃綠茂盛（圖1），由此可知，在休眠芽生長過程中，氮含量顯著影響葉片和植株的發育狀況和萌發率;DKW培養基的萌發率為52.94%，長勢狀況一般，休眠芽15 d時葉片和莖段發育較為緩慢，株高在0.5～1.0 cm，葉片較少且卷曲嚴重，莖桿細弱，植株多為芽體變大，未展葉（表4）。

該研究采用高溫滅菌法處理德陽柿休眠芽和葉片，從而獲得大量試驗所需的無菌外植體，為組織培養的研究提供良好材料[23]。同時開展德陽柿休眠芽組培快繁技術研究，為德陽柿組培快繁初代培養尋找合適的基本培養基配比和植物生長調節劑用量，提高了德陽柿初代培養過程中的植株成活率，改善了植株的生長狀況，為德陽柿的大規模批量生產和工廠化育苗提供了技術支撐。

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