靶向抑制CDK6 對人卵巢癌細胞凋亡的影響

段麗 王莉莉 馮雪 王冠 邢焱玲 孫杰 顏瑩

卵巢癌是嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤，患者存活幾率較低。卵巢癌常用的主要治療手段包括手術輔助化療和放療。近年來，盡管卵巢癌的治療手段和措施有了很大改進，但卵巢癌依然具有很高的死亡率。隨著生物技術的發展，挖掘治療卵巢癌的有效新型靶點受到許多研究者的關注[1]。細胞過度增殖與腫瘤的發生關系密切，細胞周期發生異常調控常導致細胞出現過度增殖現象。在細胞生命周期中，細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinases 6，CDK6）是哺乳動物細胞周期調控的關鍵因子，在人類大多數腫瘤組織細胞中均過度表達，一直受到研究者的關注[2]。研究表明，早期卵巢癌發生和發展常伴隨著CDK6 的過度表達，CDK6基因被靶向抑制后，人卵巢癌細胞的增殖和粘附能力能夠獲得有效抑制[3]。本研究擬進一步探討CDK6 被靶向抑制后，人卵巢癌細胞凋亡水平的變化，以期為挖掘卵巢癌的基因治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人卵巢癌細胞系HO-8910 株購買自哈爾濱醫科大學第二附屬醫院中心實驗室。CDK6 基因shRNA 表達載體由獸醫生物技術實驗室保存和鑒定，CDK6 基因和β-actin 基因擴增引物由哈爾濱博仕生物技術有限公司設計、合成。FuGENE HD 轉染試劑盒、熒光RT-PCR 試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒分別購自德國Roche 公司、美國AB 公司和南京凱基生物。CDK6 基因的shRNA 由上海吉瑪制藥技術公司設計，PGPU6/GFP/CDK6-608（shRNA-608）和無關序列PGPU6/GFP/shNC（shNC）為本實驗室構建、保存。本研究經過黑龍江省醫院倫理委員會審查和批準。

1.2 研究方法

1.2.1 CDK6-shRNA 轉染人卵巢癌HO-8910 細胞 將卵巢癌HO-8910 細胞復蘇后，培養至對數生長期狀態時，接種24 孔培養板，每孔細胞密度為5×105/mL，待細胞培養至80%左右融合時，根據轉染試劑盒說明書中的步驟，把重組質粒與轉染試劑混合，一起轉染HO-8910 細胞。實驗共分3 組：未進行轉染的空白細胞對照組（未轉染組）、無關序列轉染細胞組（shNC 組）、陽性質粒轉染細胞組（shRNA-608 組）。

1.2.2 RT-PCR 檢測CDK6 mRNA 表達 在轉染后48 h 時，進行細胞收集，根據細胞RNA 提取試劑盒的說明書，分別提取各組試驗細胞的總RNA。根據熒光定量RT-PCR 說明書進行CDK6 基因的反轉錄和PCR 擴增，用β-actin 作為內參對照，β-actin 基因引物和CDK6 基因的引物參考文獻[3]。

1.2.3 流式細胞術（flow cytometer，FCM）檢測細胞凋亡 將各組細胞消化后，制備成單細胞懸液，細胞濃度為5×105/mL，按照試劑盒說明書進行處理，避光室溫孵育10 min，1 h 內用流式細胞儀進行檢測和分析。

1.3 觀察指標

1.3.1 熒光表達觀察 使用熒光顯微鏡觀察未轉染組、shNC 組、shRNA-608 組細胞是否有熒光表達。

1.3.2 RT-PCR 檢測CDK6 mRNA 表達 使用RT-PCR 方法檢測3 組細胞CDK6 基因的表達情況。

1.3.3 流式細胞術（flow cytometer，FCM）檢測細胞凋亡 使用流式細胞儀分別檢測各組細胞凋亡的情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件對收集的數據進行統計分析，本研究中涉及3 組間的分析，采用單因素方差檢驗進行數據比較，當P＜0.05 時，組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒轉染后熒光觀察結果

無關序列組及shRNA-608 轉染組細胞均觀察到綠色熒光，細胞轉染效率均達到80%，而未轉染空白組細胞無熒光表達。

2.2 shRNA 抑制CDK6 基因mRNA 表達結果

應用熒光定量RT-PCR 檢測轉染48 h 時細胞CDK6 mRNA的相對表達情況，為避免操作等因素引起的差異，每組均設3個重復細胞孔，進行RNA 檢測。結果顯示，與shNC 組和空白對照組比較，shRNA-608 組CDK6 mRNA 表達顯著被抑制（P ＜0.001），抑制率為（48.15±0.59）%；shNC 組與未轉染組比較，CDK6 mRNA 表達量差異無統計學意義（P ＝0.724），見表1。

2.3 CDK6-shRNA 對細胞凋亡能力的影響

本試驗采用AnnexinV／PI 雙染法流式細胞術檢測不同試驗組卵巢癌細胞的凋亡情況，為避免操作等因素引起的差異，設3個重復細胞孔，進行凋亡檢測。結果顯示，shRNA-608 組卵巢癌細胞的凋亡率為（47.63±0.81）%，與shNC 組相比，差異有顯著性統計學意義（P ＜0.001），shNC 組和未轉染組細胞之間相比，細胞凋亡差異無統計學意義（P ＝0.080），見表2。

3 討論

目前臨床上缺乏卵巢癌有效的早期篩查和診斷方法，多數患者被診斷為卵巢癌時已處于晚期，常以死亡轉歸。腫瘤細胞減滅術和輔以化療是卵巢癌治療的主要方式，但部分患者治療后出現化療耐藥，病情進一步惡化或者復發，挖掘有效的藥物治療靶點，成為卵巢癌研究的熱點。癌癥的典型生物學特征是細胞周期紊亂。CDK 是細胞周期關鍵基因，在腫瘤的發生、發展中具有十分重要的作用。研究發現，CDK6 基因在多種腫瘤中過表達[4-5]。凌晨等發現CDK6 在早期卵巢癌中表達促進了早期卵巢癌發生發展[6]，羅小鵬等發現抑制CDK6 可以明顯抑制鼻咽癌細胞增殖能力及細胞周期轉化[7]。我們在前期研究中，也發現抑制CDK6 基因后，卵巢癌細胞的增殖和粘附能力也明顯受到抑制[3]。本研究發現，靶向抑制卵巢癌細胞CDK6 基因將顯著促進細胞凋亡，進一步提示CDK6 可以作為藥物靶點的可能性。

表1 各組CDK6 mRNA 的抑制情況

表2 各組卵巢癌HO-8910 細胞凋亡檢測結果

利用RNA 干擾技術進行腫瘤治療已受到極大關注[7-8]。Yan 等通過慢病毒介導的shRNA 方式，成功敲除UHRF1 基因后，HO-8910 細胞的凋亡顯著促進、細胞增殖顯著受到抑制、腫瘤細胞侵襲能力顯著降低[9]。本研究使用shRNA 技術也發現CDK6 基因的抑制顯著促進卵巢癌細胞的凋亡。基于CDK6 基因在腫瘤發生、進展過程中的重要作用，一系列CDK 的抑制劑已經完成臨床研究，部分抑制劑已上市應用于臨床治療。目前已有多種用于治療轉移性乳腺癌的CDK6 抑制劑通過了美國食品藥品管理局（FDA）的批準[10-11]。CDK6 抑制劑通過調控細胞周期，改變腫瘤細胞的微環境，激發抗腫瘤免疫反應等多個機制來有效對抗惡性腫瘤。與同樣作用于細胞周期的其他腫瘤抑制劑相比，CDK6 抑制劑在安全性方面具有優勢，為惡性腫瘤的治療帶來希望[12]。

綜上所述，CDK6 對于腫瘤的發生和發展至關重要，有望作為腫瘤治療的靶向基因。