CDK4、CyclinD1、P16在肺小細胞癌中的表達及意義

陳 威，譚敏華，黃文彥，周泳健，歐瑞芬

肇慶市第一人民醫院病理科，廣東 肇慶 526000

肺小細胞癌（Small cell lung cancer, SCLC）是一種惡性腫瘤疾病，該病的疾病進展快且自然病程短［1］。針對SCLC 這一類型的疾病，盡早的診斷疾病具有重要意義。關于SCLC 的診斷，研究表明對癌基因進行檢測具有重要意義，在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 蛋白均是引起肺癌發生的主要基因產物，通過對上述三種基因產物進行檢查，對在其檢出SCLC有重要意義［2］。SCLC有明顯的神經內分泌分化特征，屬于神經內分泌性腫瘤，其中CgA、CD56、Syn等是常見的神經內分泌抗體，在SCLC等神經內分泌分化性腫瘤的病理診斷中有著十分重要的作用。本次研究中，就具體探討了在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 的表達情況，以為疾病的早期診斷及治療提供滿意參考，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本次研究中選取2010 年8 月—2019 年12 月收治的80例SCLC 患者為研究對象，35 例非肺癌組織為對照。肺癌病理組織均參照世界衛生組織中的腫瘤分型，均是穿刺活檢組織病例。80 例SCLC 的基本資料如下：男性63 例，女性17例；年齡39～86歲，平均年齡（63.2±2.3）歲。35例非肺癌組織材料均選取自肺大皰、肺出血的患者。

1.2 檢測方法

采取免疫組化進行標本的染色，操作步驟主要如下：（1）對于穿刺活檢病理切片組織，均應用福爾馬林進行固定并且使用石蠟進行包埋，將組織切片制成5 μm的切片，用二甲苯進行脫蠟，每次10 min，總共兩次，用100%、95%、80%、70%不同梯度的乙醇進行水化，每一個梯度的水化時間均為5 min，蒸餾并且使用水洗5 min 每次，持續水洗兩次。（2）配制新鮮的濃度為3%的過氧化氫溶液，使用這一溶液來封閉內源性過氧化酶的活性，在室溫下放置15 min后用蒸餾水水洗5 min。（3）組織切片置入搭配0.01M 的枸櫞酸鈉抗原修復液中，修復液的PH 值為6.0，使用高壓進行抗原修復3 min，取出后冷卻到室溫下取出組織切片。（4）使用濃度為5%的非免疫羊血清，在37 ℃的溫度下孵育20 min，封閉以免發生非特異性抗原反應。（5）使用濾紙將多余的血清吸除，加入第一個抗體在玻片上，P16作為第一抗體，將該抗體放在4 ℃的冰箱過夜，CDK4、CyclinD1 一抗則置入37 ℃的環境中孵育120 min，PBS洗5 min，總共3次。（6）加入生物素標記二抗，比值1:200，抗體置入到37 ℃的環境中30 min，PBS 洗5 min。持續3次。（7）加入經標記后的過氧化酶的鏈酶索-親和素復合物（1∶150），在37 ℃的環境下放置30 min，PBS 洗5 min，持續3 次。（8）新鮮配備的DAB 于顯微鏡下檢測進行顯色，在合適的時間停止進行顯色，顯色后使用自來水進行沖洗。（9）應用Harris蘇木素對細胞核進行染色，應用1%的鹽酸酒精進行分化，之后充分進行水洗以返藍，在梯度酒精下充分脫水，之后用樹膠進行封片。

1.3 觀察指標

以細胞核出現棕黃色的免疫沉積物判定呈陽性，借助雙盲法，計數10 個高倍視野，按照切片中陽性細胞比作，觀察同種類型細胞數所占百分比及陽性細胞著色強度。依據切片陽性細胞占據觀察的同類細胞數百分比、陽性細胞著色強的指標，以切片中陽性細胞占計數細胞百分比進行分級，分級具體如下：小于5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2分，大于51%為3分。顯色程度判斷陽性強度，基本不著色為0分，著色呈淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3 分。每張切片著色程度得分同著色細胞百分比相乘，其中0～1 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～6 分為中等陽性（++），6 分以上為強陽性（+++），弱陽性也納入陽性判定中。

1.4 統計學方法

使用SPSS 21.0 軟件做統計學結果分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCLC與正常組織CDK4、CyclinD1、P16的比較

三種蛋白行免疫組化染色，在CDK4、CyclinD1、P16檢出的陽性率上NSCLC組織要明顯高于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 CDK4、CyclinD1、P16蛋白免疫組化檢測結果 例（%）

2.2 SCLC 患者中CgA、CD56、Syn 等神經內分泌抗體的表達

CgA、CD56、Syn的陽性表達情況，見表2。

表2 SCLC患者中CgA、CD56、Syn等神經內分泌抗體的表達 例（%）

2.3 CDK4、CyclinD1、P16表達與神經內分泌表達相關性

CDK4、CyclinD1 與CgA、CD56、Syn 表達呈正相關（P＞0.05），P16 表達與CgA、CD56、Syn 表達呈負相關（P＜0.05），見表3。

表3 CDK4、CyclinD1、P16表達與神經內分泌表達相關性

3 討論

SCLC 是起源于支氣管黏膜或腺體的肺癌疾病，該疾病的致死率非常高，因此早期診斷疾病非常關鍵［3］。對SCLC 疾病，穿刺活檢組織病理學檢查一直都是臨床診斷疾病的金標準，而一般進行這種檢測的時候，患者也常會出現典型的表現，且確診患者也多處在肺癌中晚期階段［4］。為了提高肺癌的早期檢出率，需要探討更加有效的檢測手段。

對于SCLC，研究表明此類患者CDK4、CyclinD1、P16 表達水平會出現明顯的改變，因此對這幾種物質進行檢測也就成為了SCLC 檢測的一種新的手段［5］。CDK 屬于周期蛋白依賴性蛋白激酶，該物質可以通過對絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學作用來驅動細胞周期，這屬于細胞周期中的重要調控因子［6］。CDK 活性依賴正調節亞基Cyclin 順序性表法及負調節亞基，且該物質的活性還受磷酸化與去磷酸化，對癌基因及抑癌基因進行調節，CDK家族包括1～8種亞型，CDK4 為其中的一種亞型。CyclinD1 主要為細胞周期素D1，細胞周期為連續性過程，而其中部分時間限制點對多個控制細胞周期的進程有滿意的調節作用，CyclinD1 在細胞周期中，同特異CDK 形成復合物，這樣可以調節CDK 的活性，且CyclinD1復合物也可同pRb蛋白進行結合，一同在癌細胞周期中發揮作用［7］。P16 是腫瘤細胞中常見的抑基因，這一蛋白屬于細胞周期素依賴激酶抑制物，可同CyclinD1 競爭性結合為CDK4，P16 同CDK4 進行稽核，會使CDK4 的活性受有效抑制，使得CDK4 無法解除pRb 蛋白對于轉錄因子的抑制，這樣可組織細胞的生長及分裂［8］。在正常的情況下，機體組織中的CDK4、CyclinD1、P16 不表達，而在發生癌變后這些物質就會出現表達異常的情況，且隨著癌癥的持續進展，表達水平也會持續升高，這為SCLC 的早期檢出提供有利幫助。在本次研究中，選取了SCLC 患者組織及非肺癌患者組織進行了染色及檢測，結果顯示在對CDK4、CyclinD1、P16 各物質檢出陽性情況上， SCLC 檢出各物質的陽性率上要顯著高于正常組織。而作為一種神經內分泌性腫瘤，CDK4、CyclinD1、P16 與其常見的神經內分泌分化腫瘤標志物CgA、CD56、Syn 等有何關系，是將來臨床SCLC 早期診斷研究的一個方向，對該病的診斷檢查有十分重要的意義。分析CDK4、CyclinD1、P16 與神經內分泌抗體的相關性發現，CDK4、CyclinD1 與CgA、CD56、Syn 表達呈正相關，P16表達與CgA、CD56、Syn 表達呈負相關，這能夠為臨床SCLC的早期診斷提供新的有利參考。

綜上所述，相較于正常的機體組織，在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 的表達水平高，在進行肺癌的診斷過程，采取免疫組化染色及檢測以上三種物質的方式，可以為SCLC 的早期診斷提供有利的幫助，進而為其治療提供參考，因此值得在臨床中推廣使用。