YAP1在食管癌中的表達及其對體外食管癌細胞培養化療敏感性的影響

張友明，姚 杰

(安徽省池州市人民醫院胸心外科，安徽池州 247100)

食管癌是我國高發的消化道腫瘤之一，每年食管癌死亡患者高達15萬人[1]。本病好發于40歲以上人群，男性患者多于女性，其典型癥狀以進行性吞咽困難為主，晚期患者還可能出現胸背疼痛，以及氣管、支氣管、肝、腦等臟器轉移情況[2]。Yes相關蛋白1(YAP1)是新近發現的抑癌路徑Hippo的重要調控因子。臨床研究顯示，YAP1在胃癌、非小細胞癌等多種腫瘤細胞中存在過度表達情況，提示高度活化的YAP1可能與胃癌、非小細胞癌等腫瘤疾病發生、發展有關[3]。但YAP1在食管癌中的表達及意義，以及對體外細胞培養化療敏感性的影響如何，臨床研究較少。為此，本研究選取本院保存的89例食管癌患者標本進行了分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年2月本院89例食管癌患者為研究對象，其中男49例，女40例；<60歲患者41例，≥60歲患者48例；食道上段18例，食道中段43例，食道下段28例。納入標準：(1)均經病理學檢查確診；(2)臨床病歷資料完整；(3)術前未行放化療。排除標準：(1)合并有其他系統惡性腫瘤；(2)有免疫系統疾病。食管癌患者的癌組織標本89份納入食管癌組，癌旁組織(距癌邊緣>5 cm，病理結果確認無癌細胞)標本89份納入癌旁組織組。

1.2免疫組織化學染色 兩組標本進行石蠟切片，并行常規脫蠟至水，選用北京中杉金橋生物技術有限公司提供的PV-600免疫組織化學試劑盒進行免疫組織化學檢測，所有操作根據說明書進行，將滴入YAP1抗體的標本4 ℃冷藏過夜后，選用DAB進行顯色，而后選用蘇木素復染，并于顯微鏡下觀察最終結果。

1.3體外藥敏試驗 將食管癌標本研磨碾碎，并滴加培養液，收集細胞懸液后于4 500 r/min，5 cm半徑條件下離心15 min，沉淀后加入培養液反復吹打，最終獲取腫瘤單細胞懸液，選用小牛血清對標本進行培養，并制備成細胞濃度為5×104的細胞懸液，隨后將其接種至96孔板內。設置羥基喜樹堿(HCPT)組、順鉑(CDDP)組、絲裂霉素(MMC)組氟尿嘧啶(5-FU)組、阿霉素(ADM)組及5個對照組，將15 μL 0.5 ng/mL抗腫瘤藥物滴入孔板內，于室溫下，10% CO2的溫箱內培養24 h，取出后滴入15 μL 噻唑藍(MTT)檢測試劑，15 μL不完全培養液，靜置反應3 h，4 000 r/min離心后，每孔滴入15 μL二甲基亞砜(DMSO)，反應8 min，選用南京德鐵實驗設備有限公司生產的HBS-1096C自動酶標儀檢測每孔578 nm波長時的吸光度值，試驗共重復2次，腫瘤細胞存活率取均值作為最終結果。

1.4判斷標準 (1)免疫組織化學染色結果判斷：在高倍鏡下隨機觀察10個視野，每個視野計數100個細胞，其中染色強度記分如下，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例<11%為1分，11%～<51%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性細胞比例得分之積≥3分為陽性表達。(2)化療敏感性：腫瘤細胞存活率≤50%為敏感，而>50%為不敏感。

1.5統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據處理及統計分析，計數資料以例數或百分率表示，采用配對χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1食管癌組與癌旁組織組YAP1蛋白表達 食管癌組與癌旁組織組YAP1蛋白陽性表達率分別為69.66%(62/89)、16.85%(15/89)，食管癌組YAP1蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為癌旁組織；B為食管癌組織。圖1 免疫組織化學染色圖(×200)

2.2YAP1蛋白表達與臨床病理特征關系 TNM分期Ⅲ期、中-低分化、有淋巴結轉移患者YAP1蛋白陽性表達率明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 YAP1蛋白表達與臨床病理特征關系

2.3體外化療敏感性比較 YAP1陽性表達患者HCPT、CDDP、MMC敏感率分別為56.45%、30.65%和45.16%，明顯低于YAP1陰性表達患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 YAP1陽性表達與陰性表達患者體外化療敏感性比較[n(%)]

3 討 論

Hippo信號路徑是近年發現的一組信號轉導路徑，其上游主要由調節分子Ex、Kibra等組成，核心分子則以Mst1/2、Mob1及Lats1/2等為主，效應分子則由YAP1/TAZ構成[4-5]。Hippo信號路徑活化時，效應分子表達水平將被抑制，其與細胞核的結合能力也將損傷，并因此失去轉錄輔助因子功能，導致細胞周期蛋白D1、結締組織生長因子等與增殖相關基因的表達能力被阻斷，細胞增殖受限；同時還可抑制DIPA1等與凋亡相關基因的表達，并加速細胞凋亡[6-7]。而當Hippo信號路徑失活時，效應分子YAP1/TAZ表達率將大幅增加，并進入細胞核誘導細胞增殖，同時抑制其凋亡，導致細胞惡性化[8]。未分化的干細胞內存在大量未磷酸化的YAP1，這些YAP1將介導Hippo信號路徑，并對干細胞的自我更新及增殖過程進行調節，最終影響組織器官的生長發育[9]。YAP1活性還可受Catenin蛋白調控，而Catenin蛋白同樣與腫瘤發生、發展密切相關，Catenin蛋白具有促細胞黏附，抑制細胞侵襲和轉移等功能。大量研究表明，惡性腫瘤細胞內的Catenin蛋白表達明顯降低[10-11]。有研究發現，敲除YAP1基因后，干細胞含有的高遷移率族盒蛋白2及Oct4基因表達水平將大幅下降，甚至消失，而YAP1過度表達將誘使多能干細胞編程效率提升2倍[12]。本研究中，食管癌YAP1蛋白陽性表達率為69.66%，明顯高于癌旁組織，表明YAP1蛋白異常表達與食管癌密切相關。還有研究發現，食管癌及食管不典型增生患者病灶組織內可見YAP1同時表達于細胞質及細胞核內，該研究認為慢性炎性反應癌變過程中，YAP1的高表達可能參與炎癥性疾病的惡性化，這也可能是YAP1參與惡性腫瘤發生的又一機制[13]。另外，有研究發現，宮頸鱗癌病灶組織內YAP1表達率明顯上升，高于健康組織，并且其表達率與患者疾病分化程度、淋巴結轉移及復發與否有關[14]。本研究中，TNM分期Ⅲ期、中-低分化、有淋巴結轉移患者YAP1蛋白陽性表達率明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移患者，這與前述研究結果相似，提示YAP1與腫瘤疾病分期、分化程度、是否有淋巴結轉移密切相關。

手術聯合輔助化療是多種惡性腫瘤的常用治療方案，但多數腫瘤患者存在先天性或獲得性放化療耐藥情況[15]。因此，有效地評估腫瘤患者藥物敏感性對食管癌的治療具有重要意義。本研究中，YAP1陽性表達患者對HCPT、CDDP和MMC的敏感率分別為56.45%、30.65%和45.16%，明顯低于YAP1陰性表達患者，差異有統計學意義(P<0.05)，而YAP1陽性表達和陰性表達患者對5-FU和ADM的敏感率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。通過對以上結果分析，可以發現YAP1陽性表達可降低食管癌患者對HCPT、CDDP和MMC的藥物敏感性，但對5-FU和ADM敏感性無明顯影響，臨床需酌情選用5-FU和ADM來治療YAP1陽性表達的食管癌患者。

本研究結果發現，食管癌組織內的YAP1蛋白陽性表達率明顯升高，并與TNM分期、分化程度及淋巴結轉移關系密切，同時還對患者化療藥物敏感性存在一定影響，臨床可通過檢測YAP1來評估食管癌TNM分期、分化程度及是否有淋巴結轉移，并提示患者對化療藥物的不同敏感性。但由于本組研究納入樣本量小，需要進一步擴大樣本量進行研究。