不同耐藥性鮑曼不動桿菌耐藥特征及常見耐藥基因檢測分析*

林雪霏，蔣月婷，鄧穎珊，賴斯華，寇曉霞，吳愛武△

(1.廣州醫科大學，廣東廣州 510182;2.中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室，廣東廣州 510080;3.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州 510230)

鮑曼不動桿菌是一種非發酵革蘭陰性桿菌，是醫院獲得性感染的重要機會致病菌，可引起各種感染，包括呼吸機相關性肺炎、尿路感染、皮膚傷口感染、菌血癥和腦膜炎等[1-2]。隨著廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑及各種侵入性治療的廣泛使用，近年來，多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動桿菌在醫院感染中的檢出率不斷增加，這類細菌的耐藥特點、致病力等也成為臨床研究熱點。本研究通過對不同耐藥性鮑曼不動桿菌的耐藥和生物膜基因進行檢測和分析，以期了解本地區該類細菌的耐藥表型和耐藥基因特點，為臨床防控和抗感染治療提供實驗室基礎。

1 材料與方法

1.1菌株來源 在廣州醫科大學附屬第一醫院微生物室菌種庫收集2016年1月至2018年12月臨床分離的鮑曼不動桿菌共110株。

1.2儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動微生物分析系統購自法國生物梅里埃公司，PCR儀購自美國BIO-RAD公司；G∶BOX凝膠成像系統購自信基國際貿易有限公司；雙向電泳分析儀購自北京六一儀器廠；高壓滅菌鍋購自江陰濱江醫療設備有限公司；營養瓊脂購自廣州環凱微生物科技有限公司；PCR反應試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；電泳瓊脂糖(Biowest)購自上海莼試生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定和藥敏試驗 110株收集菌株經VITEK2 Compact全自動微生物分析系統進行鑒定和藥敏分析。隨后再用PCR法檢測鮑曼不動桿菌特有的分子標記blaOXA-51-like基因，進一步確認110株菌株均為鮑曼不動桿菌，其中多重耐藥菌42株，泛耐藥菌43株，相對敏感菌25株。多重耐藥鮑曼不動桿菌定義為對10類抗菌藥物中3類或者3類以上藥物不敏感的鮑曼不動桿菌；泛耐藥鮑曼不動桿菌定義為對10類抗菌藥物中8類或者8類以上藥物不敏感的鮑曼不動桿菌；其余菌株都歸類為相對敏感鮑曼不動桿菌。

1.3.2常見耐藥基因和生物膜基因的檢測 采用煮沸法提取細菌DNA。25.0 μL反應體系：預混液12.5 μL，模板2.0 μL，10.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，滅菌雙蒸水補足體積。引物序列合成及擴增條件參考文獻[3-7]，引物序列見表1、2。在各基因陽性的菌株中分別各取1株菌株，將其相應PCR擴增產物進行純化并測序，測序結果提交到GenBank在線數據庫，應用比對工具BlastN進行比對。

表1 鮑曼不動桿菌常見耐藥基因引物序列及產物長度

表2 鮑曼不動桿菌常見生物膜基因引物序列及產物長度

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據處理及統計分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同耐藥性菌株的構成比和藥敏分析結果 110株鮑曼不動桿菌中，相對敏感菌25株，占22.7%(25/110)，相對敏感菌對大部分測試藥物敏感，這些菌株對頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦和環丙沙星均敏感。而多重耐藥菌42株，占38.2%(42/110)，多重耐藥菌對測試的抗菌藥物多表現為耐藥，耐藥率最低的是替加環素，為11.9%，其余抗菌藥物耐藥率均大于55.0%，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為92.9%、95.2%，對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為95.2%。泛耐藥菌43株，占39.1%(43/110)，泛耐藥菌對抗菌藥物高度耐藥，耐藥率最低的是替加環素，為4.7%，對其余抗菌藥物耐藥率均大于85.0%，對妥布霉素、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、氨曲南和環丙沙星均耐藥。

2.2常見耐藥基因檢測結果 在110株鮑曼不動桿菌中，耐藥基因TEM和adeB具有較高檢出率，分別為64.5%、73.6%(均>50.0%)，未檢出耐藥基因parC。在25株相對敏感菌中，耐藥基因gyrA和adeB檢出率分別為40.0%和56.0%；在42株多重耐藥菌和43株泛耐藥菌中，耐藥基因TEM和adeB具有較高檢出率，多重耐藥菌的檢出率分別為88.1%和92.9%，泛耐藥菌的檢出率分別為76.7%和65.1%。見表3。

表3 不同耐藥性鮑曼不動桿菌常見耐藥基因的檢出情況[n(%)]

對比不同耐藥性的鮑曼不動桿菌耐藥基因的檢出情況，多重耐藥菌的TEM、armA、adeB耐藥基因檢出率比相對敏感菌高，差異有統計學意義(P<0.05)。泛耐藥菌的TEM耐藥基因檢出率比相對敏感菌高，差異有統計學意義(P<0.05)。相對敏感菌株的gyrA耐藥基因檢出率比泛耐藥菌株高，差異有統計學意義(P<0.05)。多重耐藥菌的gyrA、armA、adeB耐藥基因檢出率比泛耐藥菌高，差異有統計學意義(P<0.05)。

攜帶TEM基因的71株菌株除對替加環素外，對其他抗菌藥物的耐藥率均大于70.0%；攜帶PER基因的3株菌株除對復方磺胺甲噁唑、替加環素和左氧氟沙星外，對其他抗菌藥物的耐藥率均大于60.0%；攜帶gyrA基因的25株菌株除對妥布霉素、阿米卡星、復方磺胺甲噁唑和替加環素外，對其他抗菌藥物的耐藥率大于50.0%；攜帶armA基因的15株菌株除對替加環素外，對其他抗菌藥物的耐藥率均大于60.0%；攜帶adeB基因的81株菌株除對替加環素外，對其他抗菌藥物的耐藥率大于60.0%。見表4。

表4 110株攜帶不同耐藥基因鮑曼不動桿菌的耐藥率(%)

2.3常見生物膜基因檢測結果 在110株鮑曼不動桿菌生物膜基因檢測結果中，除了bla-PER1基因以外，AbaI、Csu E 、Csu C、Csu D、Omp A、surA1、Pld、paaE基因的檢出率均較高(>65.0%)。多重耐藥菌和泛耐藥菌的paaE生物膜基因檢出率比相對敏感菌高，差異有統計學意義(P<0.05)。多重耐藥菌的surA1生物膜基因檢出率比泛耐藥菌高，差異有統計學意義P<0.05)。見表5。

表5 不同生物膜基因在不同耐藥性鮑曼不動桿菌中的檢測結果[n(%)]

3 討 論

近年來，由于抗菌藥物的濫用，鮑曼不動桿菌在國內外出現多重耐藥，甚至泛耐藥的報道不斷增多。根據中國細菌耐藥監測網(CHINET)對2005-2017年臨床常見病原菌分離及耐藥監測結果顯示，不動桿菌屬細菌耐藥率及增長率均居首位，2017年鮑曼不動桿菌對亞胺培南及美羅培南耐藥率均已大于60%，并且在多地區鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率大于80%，最高可達91.7%，已經呈現耐藥暴發狀態，導致臨床治療困難，感染病死率增加[8]。世界衛生組織已將對碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌列入對人類健康構成最大威脅細菌的關鍵組中，從而優先研究和開發治療鮑曼不動桿菌感染的方法[9]。由于抗菌藥物使用習慣的不同，同一種細菌在不同地區的耐藥表現和耐藥機制可能有差異，因此，實驗室通過研究分析及時掌握本地區細菌的耐藥特點和規律，對指導臨床合理用藥有重要意義。

本研究的110株鮑曼不動桿菌中，相對敏感菌只占22.7%，而多重耐藥菌和泛耐藥菌分別占38.2%和39.1%，后兩者合計占77.3%，說明臨床分離的鮑曼不動桿菌中絕大部分菌株都是耐藥菌株。對3類不同耐藥性的菌株進行藥敏結果分析，其中25株相對敏感菌對絕大部分藥物敏感。42株多重耐藥菌對多類抗菌藥物高度耐藥，除替加環素以外，對其余抗菌藥物耐藥率均大于55.0%，其中對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均大于90.0%。43株泛耐藥菌對絕大部分抗菌藥物高度耐藥，其中包括妥布霉素、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、氨曲南和環丙沙星。這些結果提示，對臨床分離的鮑曼不動桿菌，其抗感染治療方案的確定需慎重對待，必須綜合分析實驗室、臨床科室等部門的信息再應用。

鮑曼不動桿菌耐藥發生的機制復雜，包括：(1)產生一種或多種水解酶或鈍化酶，如超廣譜 β-內酰胺酶等，從而對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥；(2)抗菌藥物作用靶位的改變，如產生16S rRNA 甲基化酶導致對氨基糖苷類耐藥；(3)細菌主動外排系統的過度表達，adeABC是鮑曼不動桿菌中主要和特有的多重耐藥外排泵，其中adeB起主要介導作用，主要介導對氨基糖苷類、氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥[10-11]。由于基因支持著細菌的基本構造和性能，絕大部分情況下細菌的耐藥表型均受基因控制，因此，本研究對收集的菌株進行了常見耐藥基因的檢測，以便了解本地區該類細菌常見耐藥基因攜帶情況，結果顯示，adeB耐藥基因的檢出率最高，為73.6%，提示本地區分離菌株的主動外排系統過度表達是其產生耐藥性的原因之一。對不同耐藥性鮑曼不動桿菌耐藥基因檢出結果進行比較，多重耐藥菌的TEM、armA、adeB耐藥基因檢出率比相對敏感菌高；泛耐藥菌的TEM耐藥基因檢出率同樣比相對敏感菌高。以上結果提示，鮑曼不動桿菌轉變為多重耐藥菌可能與其攜帶TEM、armA、adeB耐藥基因有關，而成為泛耐藥菌可能與其攜帶TEM耐藥基因有關。鮑曼不動桿菌一旦對碳青霉烯類藥物耐藥，往往會對頭孢菌素類、青霉素類、喹諾酮類等抗菌藥物也耐藥，表現為多重耐藥，甚至泛耐藥[12]。本研究攜帶不同耐藥基因菌株的耐藥譜不完全相同，對大多數抗菌藥物的耐藥率超過60.0%。在超廣譜 β-內酰胺酶基因TEM和PER檢出菌株中，除對替加環素外，攜帶基因TEM菌株對抗菌藥物耐藥率均比攜帶基因PER菌株耐藥率高，提示攜帶TEM基因的菌株更容易導致對抗菌藥物耐藥。因此，臨床醫生應根據藥敏結果合理用藥，杜絕抗菌藥物的濫用，防止耐藥菌播散流行。

生物膜是構成細菌侵襲力的重要因子，其在細菌的黏附、感染、耐藥性與耐藥基因的傳遞、逃避宿主免疫反應等方面具有重要作用[13]。生物膜形成是一個復雜的過程，需要許多因素協同作用，例如外膜蛋白A(OmpA)、blaPER-1、CsuA/BABCDE伴侶-菌絲菌毛組裝系統，以及鐵的吸收機制(鐵螯合分子、BasD和BauA)[14-15]。不同的生長條件會影響生物膜的形成，如溫度、pH值、營養成分和光照等。有研究表明，鮑曼不動桿菌在28 ℃溫度條件下比在37 ℃溫度條件下的生物膜形成能力強，慢生長的細菌并不會使其生物膜形成能力減弱[16]。本研究結果顯示，在決定鮑曼不動桿菌生物膜形成的因素中，除了bla-PER1基因以外，AbaI、Csu E 、Csu C、Csu D、Omp A、surA1、Pld、paaE基因的檢出率均較高(>65.0%)，表明大多數臨床分離的鮑曼不動桿菌具有潛在生物膜形成能力。而多重耐藥菌和泛耐藥菌的paaE生物膜基因檢出率比相對敏感菌高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明菌株攜帶paaE生物膜基因可能與其多重耐藥或者泛耐藥有關。

4 結 論

臨床分離的鮑曼不動桿菌中絕大多數菌株均具有不同程度耐藥性，應引起臨床醫生重視，對這類細菌感染患者需根據藥敏結果合理用藥；本研究所有菌株中耐藥基因adeB的檢出率最高，提示本地區分離株的主動外排系統的過度表達是其產生耐藥性的原因之一，多重耐藥菌最常檢出的耐藥基因是TEM、armA和adeB，泛耐藥菌中最常檢出的耐藥基因是TEM和adeB； 臨床分離的鮑曼不動桿菌可檢出多種生物膜基因，具有潛在生物膜形成能力，生物膜基因paaE的攜帶可能在菌株多重耐藥和泛耐藥菌中起一定作用。