呼吸道感染耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌分子流行病學(xué)及臨床特征*

王 娟，謝良伊△，蔡 亮，歐陽鵬文，姜 斌，彭 娜，劉 念，李鳳容

(1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南長(zhǎng)沙 410005;2.湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科,湖南長(zhǎng)沙 410005;3.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,湖南長(zhǎng)沙 410005;4.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院院感科,湖南長(zhǎng)沙 410005)

近年來，隨著產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)腸桿菌科細(xì)菌的廣泛傳播，導(dǎo)致大量碳青霉烯類抗菌藥物，包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南等的使用，使得對(duì)該類藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，即耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)逐年增加。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)的數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到2017年的20.9%和24.0%，耐藥率上升幅度較大，與此同時(shí)，肺炎克雷伯菌每年的分離率也呈上升趨勢(shì)[1]。有研究報(bào)道CRE感染的肺炎患者病死率很高[2-4]。本研究分析了呼吸道感染CRE主要耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)特征，并分析其在臨床特征上的差異。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院2018年分離出的非重復(fù)呼吸道感染CRE菌株，所有菌株均經(jīng)過VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。菌株來源患者均有下列癥狀中的一項(xiàng)以上：發(fā)熱；新發(fā)的咳嗽、咳痰或原有咳嗽、咳痰加重；肺實(shí)變體征或聞及濕啰音；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10×109/L，伴或不伴有核左移；影像學(xué)有肺部陰影或間質(zhì)性改變。所有痰液標(biāo)本均為合格標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 血瓊脂平板、Mueller-Hinton瓊脂平板、VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及其配套的鑒定藥敏卡均購自法國生物梅里埃公司，PCR儀購自eppendorf公司，DYY-6K型電泳儀購自北京六一儀器廠，凝膠成像儀購自美國BIO-RAD公司，DNA Marker 2000購自寶生物工程(大連)有限公司，Trans PCR SuperMix反應(yīng)液(內(nèi)含所需ddH2O)及核酸染料購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，均購自美國微生物菌種保藏中心。

1.3藥敏試驗(yàn) 使用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。

1.4細(xì)菌耐藥表型試驗(yàn) 采用CLSI推薦的改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)進(jìn)行表型試驗(yàn)測(cè)定。

1.5細(xì)菌酶基因檢測(cè) PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因，主要檢測(cè)的基因種類包括Ambler A組酶基因中的blaKPC、blaNMC、blaIMI，Ambler B組酶基因中的blaNDM、blaIMP、blaVIM，以及Ambler D組酶基因中的blaOXA-48。

1.6多位點(diǎn)序列分型(MLST) 對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌及陰溝腸桿菌進(jìn)行MLST，采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增其7個(gè)管家基因。

1.7資料收集 收集所有菌株來源患者的年齡、性別等人口學(xué)資料，有無一年內(nèi)住院史、入住ICU史，有無靜脈置管、胸腔穿刺、氣管插管，基礎(chǔ)疾病，早期抗菌藥物暴露史及住院、預(yù)后情況等。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，采用Logistic回歸分析和χ2檢驗(yàn)對(duì)資料進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布 共收集114株非重復(fù)呼吸道感染CRE，其中肺炎克雷伯菌108株，大腸埃希菌2株，陰溝腸桿菌4株。108株肺炎克雷伯菌有101株分離于痰液標(biāo)本，7株分離于肺泡灌洗液。大腸埃希菌及陰溝腸桿菌均分離于痰液標(biāo)本。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果 肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢菌素類抗菌藥物及酶抑制劑的耐藥率超過80.0%，對(duì)阿米卡星的耐藥率為32.41%，對(duì)替加環(huán)素的耐藥率為10.19%。2株大腸埃希菌均對(duì)頭孢菌素類抗菌藥物及酶抑制劑耐藥，對(duì)替加環(huán)素及阿米卡星敏感。4株陰溝腸桿菌對(duì)替加環(huán)素、阿米卡星、環(huán)丙沙星均敏感。見表1。

表1 114株CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性分析[n(%)]

續(xù)表1 114株CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性分析[n(%)]

2.3mCIM檢測(cè)結(jié)果 114株CRE菌株，mCIM檢測(cè)結(jié)果陽性的菌株有92株，所有mCIM檢測(cè)結(jié)果陽性的菌株中85株檢測(cè)出碳青霉烯酶基因，包括79株檢測(cè)出blaKPC基因，5株檢測(cè)出blaNDM基因和1株檢測(cè)出blaIMP基因；所有mCIM結(jié)果陰性的菌株均未檢測(cè)到試驗(yàn)所覆蓋到的碳青霉烯酶基因，mCIM的靈敏度為100.0%。

2.4分子流行病學(xué)特征 114株CRE共有85株產(chǎn)碳青霉烯酶，占74.56%；108株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)酶株有84株，占77.78%，其中 KPC-2占73.15%(79/108)，NDM-1占3.70%(4/108)，IMP-4占0.93%(1/108)；2株大腸埃希菌未檢測(cè)出產(chǎn)酶株；4株陰溝腸桿菌中1株產(chǎn)NDM-1。108株肺炎克雷伯菌共分為6個(gè)ST型，以ST11型最多(77.0%)，其次為ST17，其他包括ST15、ST36、ST45、ST65；2株大腸埃希菌均為ST167型；4株陰溝腸桿菌為ST592。

2.5產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株來源患者臨床特征比較 114株CRE分為產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株，來源患者臨床特征見表2。χ2檢驗(yàn)和Logistic回歸分析結(jié)果顯示，早期的碳青霉烯類抗菌藥物使用者比例在產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且其是產(chǎn)酶株的危險(xiǎn)因素(OR:3.722，95%CI:1.529～9.057)。

表2 產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株來源患者臨床特征

3 討 論

細(xì)菌耐藥已成為全世界關(guān)注及棘手的難題，其中CRE在2017年已被WHO列為與耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌并列的三大超級(jí)細(xì)菌。這些多重耐藥菌極易在長(zhǎng)期住院或者免疫力低下的患者中進(jìn)行傳播，導(dǎo)致院內(nèi)感染，甚至可能造成小范圍或者大面積的暴發(fā)流行。呼吸道感染CRE的患者在所有感染CRE患者中占比較高。有研究報(bào)道CRE感染的類型以肺炎感染為主，其次為尿路感染，且CRE感染肺炎致死率高達(dá)60%[4]。CRE感染在臨床上是一件非常棘手的問題，目前臨床療效未見明顯提高，有回顧性研究顯示CRE的治療常需要聯(lián)合用藥[5-8]，同時(shí)單藥治療的理論也有學(xué)者提出[4]。CRE治療是聯(lián)合用藥還是單藥治療，聯(lián)合哪些藥物，如何聯(lián)合，目前仍未明確。

有研究對(duì)CRE進(jìn)行體外藥敏性分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(包括廣譜類頭孢菌素類、頭霉素類、β-內(nèi)酰胺加酶抑制劑類及臨床常用3種碳青霉烯類抗菌藥物)、喹諾酮類抗菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥[9-10]，與本研究結(jié)果相一致。CRE敏感性較高的藥物為替加環(huán)素、阿米卡星等，這也驗(yàn)證了KULENGOWSKI等[11]的研究結(jié)果，即碳青霉烯類抗菌藥物聯(lián)合其他種類抗菌藥物可以對(duì)CRE的治療起一定作用。

在CLSI推薦的M100-S27文件中也已經(jīng)將mCIM作為碳青霉烯酶表型篩選的參考方法之一，同時(shí)也有研究顯示改良Hodge試驗(yàn)和Carba NP試驗(yàn)在檢測(cè)產(chǎn)OXA-48酶和黏液型產(chǎn)NDM酶菌株時(shí)容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，而mCIM則為陽性結(jié)果，mCIM的靈敏度更高[12]。本試驗(yàn)采用mCIM進(jìn)行碳青霉烯酶表型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有檢出酶基因型的菌株其mCIM結(jié)果都為陽性，所有表型陰性的菌株均未檢出本試驗(yàn)包括的7種酶基因，證實(shí)了mCIM對(duì)碳青霉烯酶基因檢出的靈敏度高。114株呼吸道CRE中85株碳青霉烯酶基因陽性，占74.56%，表明產(chǎn)酶是CRE的主要耐藥機(jī)制。肺炎克雷伯菌主要以產(chǎn)碳青霉烯酶為主，對(duì)blaKPC基因進(jìn)行亞型分型，主要為KPC-2型；大腸埃希菌未檢測(cè)出酶基因型，4株陰溝腸桿菌中1株為NDM-1型。2017年中國學(xué)者ZHANG等[13]對(duì)全國1 105株不同類型標(biāo)本分離的CRE進(jìn)行分析，其主要產(chǎn)酶及酶亞型與本研究大致相同。英國一項(xiàng)研究報(bào)道CRE主要菌株類型為肺炎克雷伯菌，但酶基因主要為NDM[14]。一項(xiàng)北美的綜合性回顧性研究表明KPC亞型主要為KPC-3，其次為KPC-2[15]。本研究對(duì)近年報(bào)道在腸桿菌科細(xì)菌中出現(xiàn)的blaOXA-48酶基因進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)該基因型菌株，而該酶常在其他國家的腸桿菌科細(xì)菌中檢出，尤其是歐洲國家[16]。MLST分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌主要流行株為ST11，占全部菌株的77.0%，這與ZHANG等[13]對(duì)我國肺炎克雷伯菌的分型一致，在美國及其他很多國家肺炎克雷伯菌的主要ST型為ST258[10，17]；大腸埃希菌的主要表型為ST167，而ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌主要ST型為ST131。

本研究臨床資料分析顯示，早期碳青霉烯類抗菌藥物暴露史是CRE產(chǎn)酶株的一個(gè)危險(xiǎn)因素，與新加坡一項(xiàng)關(guān)于成人住院患者CRE分子流行病學(xué)及臨床特征的研究結(jié)果一致[18]。同時(shí)也有中國研究者報(bào)道菌株分離前第三、四代頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物的使用是導(dǎo)致碳青霉烯類耐藥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。

目前，CRE耐藥情況在抗菌藥物廣泛使用下日趨嚴(yán)重，本研究通過對(duì)呼吸道感染CRE流行病學(xué)及臨床特征的分析發(fā)現(xiàn)，早期碳青霉烯類抗菌藥物的使用是造成CRE產(chǎn)碳青霉烯酶的一個(gè)危險(xiǎn)因素，提示臨床工作者在抗菌藥物的選擇與使用上應(yīng)謹(jǐn)慎，鑒定產(chǎn)酶株可為臨床醫(yī)務(wù)者在用藥劑量及種類選擇上給予一定的參考依據(jù)，同時(shí)CRE分子流行病學(xué)特征也為院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)與控制提供了一定理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

產(chǎn)碳青霉烯酶為CRE耐藥的主要原因，早期的碳青霉烯類抗菌藥物暴露是CRE產(chǎn)酶株的危險(xiǎn)因素。