MALDI-TOF MS直接檢測清潔中段尿液標本中病原菌的價值*

徐令清,張岡毅,鐘子瑩,溫偉洪,湯英賢,鐘國權,李介華,劉麗忠

(廣州醫科大學附屬第六醫院/清遠市人民醫院檢驗科，廣東清遠 511518)

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)是一種新型的軟電離生物質譜儀，對臨床微生物的細菌鑒定具有非常大的作用，不僅能快速鑒定純菌落，還能直接從臨床標本中檢測細菌，不需培養，只需進行簡單的預處理，如離心、血細胞溶解等，還可以進行分子水平的基因分型、藥物敏感性分析和無菌體液的直接鑒定等。目前，臨床主要依靠傳統手工法及自動化鑒定儀檢測病原微生物，傳統的技術具有周期長、費用高、鑒定能力有限和信息滯后的缺陷。但MALDI-TOF MS能夠完成微生物多種成分的分析，包括蛋白質、脂類、多肽等[1]。MALDI-TOF MS技術應用于細菌的鑒定，實際上就是檢測具有屬、種或亞型特異性的生物標志物質量信號，它主要通過分析不同細菌具有的不同蛋白質指紋圖譜，對鑒定結果與數據庫中已知的細菌進行比對，得出各種細菌鑒定結果。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2018年10月至2019年3月本院住院及門診患者的清潔中段尿液標本共300份。

1.2儀器與試劑 儀器：MALDI-TOF MS購自德國布魯克公司，Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(Vitek 2 Compact)購自法國生物梅里埃公司，BD phoenixM50全自動微生物分析系統(BD M50)購自美國BD公司，T100TMPCR擴增儀、電泳儀、Gel DoxTM XR+凝膠成像系統購自美國BIO-RAD公司。試劑：MALDI-TOF MS所用試劑包括三氟乙酸、色譜級乙腈、70%甲酸和無水乙醇，均為廠家配套試劑。哥倫比亞血瓊脂平板購自廣州迪景微生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、Gel Red核酸染料和Marker DNA Ladder購自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1尿液標本培養 采用10 μL的接種環將中段尿液標本接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，37 ℃ CO2培養箱培養18～24 h。

1.3.2尿液標本質譜分析前處理 取10 mL的尿液標本倒入無菌的15 mL離心管中，以2 000 r/min轉速離心4 min，去除蛋白。離心完畢后，將上清液倒入另外一支無菌的15 mL離心管中，在20 ℃下以12 000 r/min離心5 min。棄上清液，在沉淀中加入1 mL 0.45%氯化鈉注射液，轉到1.5 mL的EP管中，充分振蕩混勻后12 000 r/min離心5 min。棄上清液，用1 mL去離子水洗滌沉淀，同樣轉速和時間離心，棄上清液，留沉渣待用。

1.3.3MALDI-TOF MS分析尿沉渣 采用加樣槍吸取1 μL沉淀物均勻涂抹于96孔靶板上，待干燥。再加入1 μL 70%甲酸，干燥，再加上1 μL基質液涂抹均勻，干燥后進行質譜分析。標本干燥后將靶板放入MALDI-TOF MS檢測。MALDI-TOF MS收集的質量范圍為2 000～20 000 Da，圖譜采集使用Flex Control軟件，使用Bruker Biotyper軟件對檢測結果與標準數據庫進行對比，用分值量化和判定結果，評分≥2.0分表示可鑒定到種的水平；評分為1.7～<2.0分表示可鑒定到屬的水平；評分<1.7分則表示無法給出可信的鑒定結果。

1.3.4菌落鑒定 首先采用MALDI-TOF MS進行菌落鑒定，然后使用Vitek 2 Compact、BD M50兩種儀器對菌落進行復核鑒定。

1.3.516sRNA檢測 尿沉渣直接通過MALDI-TOF MS分析得到的陽性結果中挑選出7株細菌提取DNA，進行16sRNA擴增，具體操作參照文獻[13]。PCR產物送上海生工生物工程股份有限公司測序，驗證MALDI-TOF MS的準確性。

1.4統計學處理 采用Excel2007軟件進行數據處理及統計學分析。

2 結 果

2.13種儀器對單一菌感染尿液標本培養菌落鑒定符合率 300份中段尿液標本中，3種儀器均檢測出單一菌感染63株，其中肺炎克雷伯菌8株，大腸埃希菌40株，糞腸球菌9株，銅綠假單胞菌3株，產氣腸桿菌1株，里昂葡萄球菌1株，黏質沙雷菌1株，MALDI-TOF MS菌落鑒定結果與BD M50 及Vitek 2 Compact檢測結果一致，符合率為100.0%。尿液標本培養結果表明，革蘭陰性菌為尿路感染主要的致病菌，大腸埃希菌最為常見(57.7%)，肺炎克雷伯菌次之(15.4%)；革蘭陽性菌也占少數，以糞腸球菌為主(7.7%)。

2.2單一菌感染中MALDI-TOF MS檢測尿沉渣與菌落鑒定結果的比較 MALDI-TOF MS直接檢測尿沉渣共得到25份陽性結果，尿沉渣總檢出率為39.7%(25/63)；其中肺炎克雷伯菌培養后采用MALDI-TOF MS進行菌落鑒定共檢出菌株8株，尿沉渣檢出4株，尿沉渣檢出率為50.0%；大腸埃希菌培養后采用MALDI-TOF MS進行菌落鑒定共檢出菌株40株，尿沉渣檢出15株，尿沉渣檢出率為37.5%；糞腸球菌培養后采用MALDI-TOF MS進行菌落鑒定共檢出菌株9株，尿沉渣檢出2株，尿沉渣檢出率為22.2%；銅綠假單胞菌培養后采用MALDI-TOF MS進行菌落鑒定共檢出菌株3株，尿沉渣檢出1株，尿沉渣檢出率為33.3%；產氣腸桿菌、里昂葡萄球菌、黏質沙雷菌培養后采用MALDI-TOF MS進行菌落鑒定共檢出菌株各1株，尿沉渣檢出各1株，尿沉渣檢出率均為100.0%。 見表1。

表1 單一菌感染的中段尿液標本菌株檢出情況

2.3混合菌感染中MALDI-TOF MS尿沉渣檢測與菌落鑒定結果的比較 培養結果為兩種細菌感染的標本有20份，MALDI-TOF MS進行培養菌落鑒定的優勢菌為糞腸球菌6株(30.0%)，大腸埃希菌5株(25.0%)，溶血葡萄球菌4株(20.0%)，無乳鏈球菌2株(10.0%)，屎腸球菌2株(10.0%)，銅綠假單胞菌1株(5.0%)，非優勢菌主要為表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、棒狀桿菌、氣單胞菌、鏈球菌等常見污染菌，而MALDI-TOF MS直接從2份尿沉渣中檢出2株屎腸球菌(優勢菌>104CFU/mL)，檢出率為10.0%(2/20),其他優勢菌及非優勢菌在尿沉渣中均未直接檢出。

2.416sRNA擴增及測序結果 7株細菌擴增結果見圖1，測序經過https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網站BLAST比對，分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、產氣腸桿菌、里昂葡萄球菌、黏質沙雷菌，與Vitek 2 Compact及MALDI-TOF MS鑒定結果完全一致。

注：M為標記物，200～4 500 bp；泳道1～7分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、產氣腸桿菌、里昂葡萄球菌、黏質沙雷菌。圖1 7株細菌16sRNA擴增結果

3 討 論

MALDI-TOF MS以快速、準確、重復性好、高通量的特點在細菌的鑒定、耐藥性和毒力監測中發揮越來越重要的作用[2]。MALDI-TOF MS還應用于其他方面的研究，例如用于流行病學的研究、基因分型、血培養報陽瓶的直接鑒定(MALDI SepsityperTM試劑盒)和其他體液或選擇性肉湯培養標本的直接鑒定等。傳統的細菌培養和生化鑒定方法無法對大腸埃希菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等多種血清型病原菌進行分類，而現在MALDI-TOF MS對多種血清型細菌進行鑒定和分類已得到初步應用[3]。王曄茹等[4]應用優化的MALDI-TOF MS試驗條件對含有沙門氏菌的患者糞便標本進行檢測和分型，并與血清學分型進行比較。對于血培養報陽的標本，MALDI-TOF MS的鑒定率較高，可用于處理混合感染的標本；KOK等[5]使用MALDI SepsityperTM試劑盒對507份血培養陽性的標本直接進行MALDI-TOF MS檢測，鑒定出379份(74.8%)陽性標本，其中358份為單一菌感染，21份為混合菌感染。

目前，MALDI-TOF MS技術在臨床微生物的診斷上具有優勢，主要應用于細菌和真菌的菌種鑒定，但是在某些方面還是存在不足。如在檢測單一菌種的標本時，MALDI-TOF MS 的檢測結果可能無法達到菌落鑒定的相對分值，如菌落鑒定為大腸埃希菌的40份尿液標本中，有11份標本直接檢測評分≥2.0分，4份標本評分為1.7～<2.0分，1份標本評分<1.7分，剩余14份標本無圖譜，而其他尿沉渣檢測不是大腸埃希菌的標本有10份。造成上述這種現象的主要原因可能包括標本中細菌的含量少，菌量不一，存在部分的干擾物質，光譜采集不準確等；而菌量較多的峰圖信號好，鑒定值高，結果可靠；菌量少的峰圖信號不好，鑒定準確度不高，檢測結果不佳；未檢出的和無法鑒定是大腸埃希菌的標本可能是因為菌量太少，也有可能是尿液標本中還存在蛋白質、混合細菌等干擾物質，導致檢測結果不可靠[6-7]。也有學者提出“短期培養法”，4～6 h后采集菌膜并用MALDI-TOF MS直接檢測，準確率可得到明顯提高[8]。

在本研究中，中段尿液標本經培養后菌落鑒定為單一菌感染的63份標本，而MALDI-TOF MS檢測尿沉渣的鑒定陽性率為39.7%(25/63)；兩種細菌混合感染的標本有20份，MALDI-TOF MS鑒定的陽性率為10.0%(2/20)。從中可以看出兩種細菌混合感染的陽性率遠低于單一細菌感染的陽性率[9]。而WANG等[10]的研究發現尿液標本中兩種細菌只有優勢菌能夠被檢出。在本研究中，MALDI-TOF MS檢測混合菌感染的中段尿液標本時，優勢菌數量比非優勢菌數量高一個數量級，受非優勢菌干擾的概率較低。

MALDI-TOF MS直接檢測尿沉渣與尿液標本培養菌落鑒定有一定的差異，可能受到以下幾種因素影響[11]：(1)尿液標本直接洗滌離心，細菌和蛋白可能混在沉淀中，導致質譜峰圖不佳，檢出率低；(2)尿液標本沒有經過培養，菌量少，從而無法得出鑒定結果；(3)MALDI-TOF MS光譜采集不準確，菌量低于檢出限等。

尿路感染是人類常見的感染性疾病，95%以上的尿路感染是由單一細菌引起的，其中約90%的門診患者和50%的住院患者感染的病原菌為大腸埃希菌，但也有少部分患者感染金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、念珠菌等。傳統的尿路感染診斷依靠尿液分析、尿沉渣技術、革蘭染色鏡檢和細菌培養等，但目前臨床更偏向于使用快速準確的檢測技術。有研究對尿路感染的220份尿液標本進行常見的MALDI-TOF MS直接鑒定，當菌量>105CFU/mL時，鑒定到屬的檢出率為92.7%，鑒定到種的檢出率為91.8%，特別是對大腸埃希菌的鑒定，檢出率達到97.6%，檢出時間也極大縮短[12]。臨床上尿液標本的培養一般需要24 h，應用MALDI-TOF MS則可以快速完成菌種的鑒定。對于混合菌感染的尿液標本，MALDI-TOF MS也可報告優勢菌，節省了分純培養的時間,為獲得更好的治療爭取了時間并減少了費用。而16sRNA擴增技術的靈敏度與培養結果具有很好的一致性；并且在診斷使用過抗菌藥物的患者標本中，具有更多的優越性[13]。

4 結 論

MALDI-TOF MS的推廣和使用，不僅能優化檢驗流程，還可以節省大量的成本和時間，快速準確地鑒定病原菌，對臨床細菌感染的診斷及治療具有重大意義。