可溶性Tim-3及Galectin-9在結核性腦膜炎患者腦脊液中的表達及意義*

孫 霞，王 麗，李庭毅

(湖北省孝感市中心醫院神經內科二病區，湖北孝感 432000)

結核性腦膜炎是一種中樞神經系統的傳染病[1-2]。結核性腦膜炎臨床表現復雜，臨床診斷比較困難[3]。目前，結核性腦膜炎的診斷主要基于腦脊液分析，但靈敏度和特異度均較低，且耗時長[4]。 因此，有必要尋找靈敏度和特異度均較高的生物標志物用于快速診斷或排除結核性腦膜炎。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)特異性表達于終末分化的CD4+Th1細胞[5]。有研究證明了Tim-3在適應性免疫細胞及先天性免疫細胞上的表達，包括樹突狀細胞、巨噬細胞和肥大細胞[6-7]。 Tim-3的天然配體是半乳糖凝集素-9(Galectin-9)，后者是一種結合β-半乳糖苷的凝集素。Tim-3與Galectin-9的相互作用在免疫調節中起著至關重要的作用[8-9]。本研究擬探討可溶性Tim-3、Galectin-9在結核性腦膜炎患者腦脊液中的表達及意義，為結核性腦膜炎的早期診斷及治療提供理論及臨床依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年4月至2018年9月本院收治的結核性腦膜炎患者86例為病例組，病程(9.93±5.64)年，均符合《臨床診療指南結核病學分冊》的診斷標準[10]。選擇同期以頭痛癥狀為主，但神經系統查體、腦脊液及相關輔助檢查均正常的患者76例為對照組。病例組及對照組在血壓、年齡、性別比例、吸煙比例、飲酒比例等方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。研究對象排除標準：(1)妊娠期或近3個月有手術史、創傷史；(2)存在冠心病以外的其他心臟病、心功能不全，合并未控制的嚴重高血壓、瓣膜性心臟病，接受過急診冠狀動脈介入治療；(3)由于其他因素而導致的中樞或周圍神經病變；(4)嚴重高血壓、呼吸道疾病、周圍血管性疾病或栓塞性疾病。 研究對象終止、退出標準：(1)患者依從性差；(2)出現嚴重不良事件及其他原因致使繼續試驗困難。所有研究對象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準后進行(倫理獲批號：NO2019倫審-43號)。

表1 對照組與病例組基礎資料的比較

1.2儀器與試劑 MK3-3酶標儀購自美國熱電儀器公司；Tim-3、Galectin-9、白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-8、IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.3腦脊液標本采集 所有患者均在就診后 24 h 內接受腰椎穿刺術，獲取腦脊液標本3 mL，將腦脊液標本立即以1 300×g離心10 min，并將上清液置入1.5 mL微量離心管中在—80 ℃冰箱儲存。

1.4檢測方法 ELISA法檢測腦脊液Tim-3、Galectin-9、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平。以檢測Tim-3為例，根據廠家的說明書，向每個孔中加入100 μL標本稀釋劑，然后向孔中加入10 μL標準品、標本。將微量滴定板在37 ℃下孵育20～24 h。洗滌后，每孔加入100 μL的抗人Tim-3過氧化物酶綴合的單克隆抗體，在室溫下溫育2 h。洗滌后，向每個孔中加入色原3,3,5,5′-四甲基聯苯胺。在室溫下進行30 min酶反應。通過加入終止溶液(0.35 mol/L Na2SO4)終止顯色底物反應，并在450 nm處讀取吸光度值。使用由標準品繪制的校準曲線計算結果。

2 結 果

2.1兩組間Tim-3、Galectin-9水平比較 病例組Tim-3、Galectin-9水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組間Tim-3、Galectin-9水平的比較

2.2兩組間IL水平比較 病例組IL-2、IL-4、IL-8、IL-10水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組間IL-2、IL-4、IL-8、IL-10水平的比較

2.3兩組間IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平的比較 病例組TNF-α、hs-CRP、ESAT-6均明顯高于對照組，IFN-γ明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組間IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平的比較

2.4Tim-3、Galectin-9與各變量的相關分析 Tim-3、Galectin-9與IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6呈正相關(P<0.05)，與IFN-γ呈負相關(P<0.05)。見表5。

表5 Tim-3、Galectin-9與各變量的相關分析

2.5結核性腦膜炎患者發生死亡事件的多元Logistic回歸分析 對結核性腦膜炎患者進行1年隨訪，發生死亡18例。以結核性腦膜炎患者是否發生死亡事件為因變量(是=1，否=0)，單因素分析有意義的因素為自變量進行多因素Logistic逐步回歸分析，結果發現高水平的Tim-3、Galectin-9、ESAT-6均為結核性腦膜炎患者發生死亡事件的危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 結核性腦膜炎患者發生死亡事件的多元Logistic回歸分析

2.6Tim-3及Galectin-9診斷結核性腦膜炎的性能分析 ROC曲線分析顯示，Tim-3、Galectin-9兩者單獨檢測診斷結核性腦膜炎的ROC曲線下面積(AUC)相近，均小于Tim-3聯合Galectin-9；Tim-3、Galectin-9單獨檢測診斷結核性腦膜炎的靈敏度、特異度相近，差異無統計學意義(χ2=1.219、1.695，P>0.05)，均小于Tim-3聯合Galectin-9，差異有統計學意義(χ2=16.249、17.023，20.325、19.587，P<0.05)。 見表7、圖1。

表7 Tim-3及Galectin-9診斷結核性腦膜炎的性能分析

注：A為Tim-3聯合Galectin-9;B為Tim-3;C為Galectin-9;D為參考線。圖1 Tim-3及Galectin-9診斷結核性腦膜炎的ROC曲線

3 討 論

結核性腦膜炎感染仍然是一個全球性的健康問題。根據世界衛生組織的報告，全球結核性腦膜炎的發病率每年增長0.4%，特別是在發展中國家該病發病率增長更快[11]。結核分枝桿菌感染是患者發病和死亡的主要原因，延遲或不治療會增加患者發生不可逆的神經系統后遺癥和死亡的風險[12]。

Tim-3、Galectin-9是免疫細胞因子，其產生可能與結核性腦膜炎病理學的發展有關，包括組織壞死和惡病質[13-14]。在中樞神經系統中，Tim-3、Galectin-9已被證明可誘導發熱反應，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，并觸發其他細胞因子的釋放，包括IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、hs-CRP等[15-16]。Tim-3、Galectin-9在中樞神經系統中還可能依賴于由常駐細胞群或浸潤的白細胞(例如T細胞)產生的其他細胞因子的存在。由于Tim-3、Galectin-9可以從免疫細胞中主動分泌，或者從垂死細胞被動釋放到細胞外空間，Tim-3、Galectin-9的釋放作為一種危險信號，代表一種壓力狀態和對某些刺激的炎性反應。一項前瞻性研究表明，腦缺血患者血清Tim-3、Galectin-9水平升高[17]。在Tim-3、Galectin-9過表達的轉基因小鼠海馬中表現出明顯的小膠質細胞增多，表明Tim-3、Galectin-9能誘導神經元細胞損傷[18]；用Tim-3、Galectin-9處理少突膠質細胞，這些細胞對Fas介導的細胞凋亡更敏感。Tim-3、Galectin-9可調控免疫細胞的定向轉移和趨化性，并激活淋巴細胞、內皮細胞、中性粒細胞、上皮細胞上相應的趨化因子受體。在大鼠肝纖維化試驗中，Tim-3、Galectin-9促進淋巴細胞、巨噬細胞凋亡，并抑制淋巴細胞、巨噬細胞從脾臟向肝臟的轉移，參與炎性反應[19-20]。本研究結果顯示，病例組Tim-3、Galectin-9、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6水平均高于對照組，IFN-γ水平低于對照組；Tim-3、Galectin-9與IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、ESAT-6呈正相關，與IFN-γ呈負相關。這與上述討論符合，結合Logistic回歸分析，高水平的Tim-3、Galectin-9、ESAT-6均為結核性腦膜炎患者發生死亡事件的危險因素，說明結核性腦膜炎患者腦脊液中Tim-3、Galectin-9水平升高，高水平的Tim-3、Galectin-9可能與結核性腦膜炎病情嚴重程度關系密切。研究表明，Tim-3、Galectin-9通過堿基互補配對與靶RNA的編碼區特異性結合抑制RNA的翻譯，激活淋巴細胞錨定融合血管內壁，促進免疫細胞束縛病變靶細胞，而一些細胞免疫活性因子(MCP-1、TNF-α、IL-2、IL-8)與Tim-3、Galectin-9表達呈正相關[21]，這也證實了本研究的觀點。本研究同時發現Tim-3、Galectin-9兩者單獨檢測診斷結核性腦膜炎的AUC、靈敏度、特異度相近，均小于Tim-3聯合Galectin-9。這提示Tim-3、Galectin-9聯合診斷結核性腦膜炎具有較高的靈敏度、特異度。

4 結 論

結核性腦膜炎患者腦脊液中Tim-3、Galectin-9水平升高，高水平的Tim-3、Galectin-9水平與結核性腦膜炎病情嚴重程度關系密切；Tim-3、Galectin-9聯合診斷結核性腦膜炎具有較高的靈敏度、特異度，值得在臨床上推廣應用。