內蒙古自治區3 500例新生兒遺傳性耳聾基因位點篩查分析*

周雪原，馬玉珍，李 靈，秦 磊，龐曉燕，侯東霞，冀小平△，王曉華▲

(1.內蒙古自治區婦幼保健院遺傳優生科，內蒙古呼和浩特 010020； 2.內蒙古自治區人民醫院生殖中心，內蒙古呼和浩特 010017)

耳聾是最常見的致殘疾病，據全國第二次殘疾人抽樣調查顯示，我國約有2 780萬聽力障礙人士，約占總殘疾人數的33.5%[1]。耳聾與外界環境和遺傳等多種因素有關，60%的耳聾與遺傳有關[2]。有研究表明，80%的遺傳性耳聾是由GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3功能基因突變引起[3-5]。本研究采用聯合探針錨定聚合測序法檢測遺傳性耳聾常見的4個致病基因20個位點，了解內蒙古自治區新生兒遺傳性耳聾基因突變情況，為本地區新生兒遺傳病防治、預防出生缺陷提供數據支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月1日至6月30日在內蒙古自治區婦幼保健院正常分娩的3 500例新生兒為研究對象，所有研究對象家屬均自愿讓新生兒接受遺傳性耳聾基因檢測，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 華大生物科技有限公司核酸純化試劑、測序反應通用試劑盒(聯合探針錨定聚合測序法)、遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(聯合探針錨定聚合測序法)、基因測序儀(BGISEQ-500)。

1.3方法

1.3.1標本采集 3 500例新生兒均采集足跟血，并制成干血斑，4 ℃保存備用。

1.3.2基因組DNA提取 使用干血斑核酸提取試劑盒提取基因組DNA。DNA水平經測定，在20～50 ng/μL為宜，-20 ℃暫存備用。

1.3.3文庫制備 將提取基因組DNA標本經過打斷修復，接頭連接，PCR擴增進行文庫制備。配制打斷修復混合液，將基因組DNA打斷修復。每個標本分別加入15 VL標簽接頭，接頭與模板DNA結合，使每個模板都有特定標簽并純化。對模板進行PCR擴增，PCR擴增程序：94 ℃ 120 s，1個循環；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，35個循環；72 ℃ 300 s，1個循環；12 ℃暫存。擴增產物純化并測定其水平，≥2 ng/μL為合格。

1.3.4測序 針對新生兒進行的遺傳性耳聾基因篩查僅針對常見的基因及其相關位點，如有突變，原則上召回并行相關基因突變位點測序，進一步給予臨床指導。采用測序反應通用試劑盒(聯合探針錨定聚合測序法)進行測序。

1.4統計學處理 數據分析應用遺傳性耳聾基因分析軟件，按照測序后數據分析標準流程操作，至少兩人對測序數據進行分析整理，并核對。

2 結 果

2.1耳聾基因突變率統計 3 500例新生兒血液標本中，行遺傳性耳聾4個基因20個位點篩查，總突變193例，總突變率為5.51%；雜合突變178例(含線粒體異質突變1例)，雜合突變率為5.09%；純合突變15例，純合突變率為0.43%。其中GJB2、GJB3、SLC26A4均為雜合突變，線粒體12SrRNA異質突變1例，均質突變15例。見表1。

表1 耳聾基因篩查各位點突變率

2.2基因突變患兒隨訪情況 3 500例新生兒中有193例異常結果，其中常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾相關GJB3基因雜合突變17例，均為538C>T位點突變；線粒體12SrRNA基因均質突變15例，異質突變1例。GJB3基因雜合突變與高頻聽力下降有關，可導致進行性或遲發型中度至極重度耳聾。對本次檢測出的17例新生兒于2019年5月進行電話回訪，家長表示1歲左右的受檢者暫時未發現癥狀，建議患兒來耳鼻喉科例行體檢，計劃2020年5月再回訪一次，持續監測受檢者聽力損傷情況。線粒體12SrRNA基因突變15例，均電話告知若受檢者就醫需提醒醫生，該受檢者對氨基糖苷類藥物敏感，可出現“一針致聾”情況。2018年11月15例線粒體12SrRNA基因均質突變受檢者母親、同胞、母親同胞姐妹、祖母等家族女性都做相應突變基因驗證，發現除1例均質突變受檢者無聯系方式未回訪，14例受檢者中，有5例存在家族遺傳史，其中2個家族為均質突變遺傳，另3個家族有均質突變和異質突變病例；其余9例為新生兒突變，母親和同胞等家族女性檢測結果均正常，受精卵發育過程中出現相關基因突變。本研究對線粒體12SrRNA基因突變的家族分析，會在相應的家族統計文章中詳細體現。

3 討 論

據國內耳聾基因流行病學調查顯示，我國遺傳性耳聾基因大部分由4個基因突變引起：GJB3、GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA，較常見的遺傳性耳聾突變基因為GJB2，其次為SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3[6-9]。攜帶有遺傳性耳聾基因突變位點的女性在孕期可通過羊水穿刺對胎兒進行耳聾基因檢測。對胎兒進行耳聾基因突變情況及出生后干預評估，可避免下一代致聾或攜帶致病基因，有效降低生育耳聾新生兒的風險。攜帶有線粒體12SrRNA相關突變位點的準媽媽，可有效防止“一針致聾”，并對其子女做好藥物防護。有地方性研究發現新生兒耳聾基因陽性率高達4.98%[10-13]。本研究共檢測隨機時間段出生的3 500例新生兒，有193例新生兒存在單雜合耳聾基因突變，總突變率為5.51%，排除易感基因突變位點增多的因素，內蒙古自治區新生兒遺傳性耳聾基因異常攜帶率明顯高于其他文獻報道[10-13]，本研究有一定臨床參考價值。

GJB2基因突變導致的耳聾為語前、雙側、對稱性耳聾，聽力損失程度變異較大，可由輕度到極重度，但多數為重度或極重度耳聾，GJB2基因和先天性耳聾有著密切關系。GJB2基因主要以常染色體隱性遺傳方式向后代傳遞，此類遺傳方式可通過分別獲取來自父母的致聾基因引起耳聾。GJB2基因突變是常見的耳聾基因，GJB2基因同一位點純合突變或兩個不同位點雜合突變均可致聾[14]。本研究檢測GJB2基因攜帶者有82例，雜合突變率為2.34%，攜帶者不會發病，但要密切關注，如果有聽力損失方面的臨床癥狀，建議做進一步耳聾基因檢測，排除其他罕見耳聾基因位點突變。同時攜帶GJB2基因不同位點突變的夫妻，其子女發病風險為1/4，攜帶風險為1/2，正常概率為1/4。由于GJB2基因突變致聾符合人工耳蝸移植條件，可在出生18個月后進行人工耳蝸移植，避免由聾致啞。

GJB3基因的相關突變臨床多表現為高頻聽力受損的進行性語后聾。GJB3基因是在我國本土克隆的第一個疾病相關基因。本研究中GJB3基因突變17例，單雜合突變率0.49%，與全國基因突變率基本一致[15-16]。GJB3基因突變可導致常染色體顯性或隱性遺傳非綜合征型耳聾，GJB3基因編碼連接蛋白，547G>A為錯義突變，使連接蛋白31(Cx31)183號谷氨酸變為賴氨酸；538C>T為無義突變，使180號堿基位置突然編碼終止。GJB2基因編碼的連接蛋白26與GJB3基因編碼的Cx31相互作用也可能引發耳聾。如果患者GJB3基因有突變，發現聽力下降需及時到耳鼻喉科就診，避免延誤病情。

SLC26A4是俗稱的“一巴掌致聾”基因，這個基因異常會導致后天遲發型耳聾，以及臨床上常見的大前庭水管綜合征。本研究中SLC26A4單雜合突變率為2.23%，與國內地方統計數值基本一致[17]。SLC26A4基因異常者主要表現為聽力漸進性下降，如劇烈運動、頭部磕碰等顱內壓劇烈變化的情況下聽力會出現明顯下降[18]。該基因遵循隱性遺傳的方式，大部分患兒的父母聽力正常，患兒出生時聽力正常，偶然一次玩耍、生病、打架之后致聾，如果提前預知其危險性，可避免或延緩耳聾的發生，將耳聾推遲至語言系統發育完善后。因此，盡早檢測SLC26A4基因對兒童發育至關重要。

12SrRNA基因是線粒體基因，是俗稱的“一針致聾”基因，攜帶該基因突變者使用一次性劑量的氨基糖苷類抗菌藥物，如鏈霉素、慶大霉素等，便可致耳聾。本研究中有線粒體12SrRNA基因突變16例，突變率0.46%，與國內其他地方統計值基本一致[19]。該基因為線粒體基因，遵循母系遺傳的方式。母親為耳聾型藥物的敏感人群，子女及其后代均為藥物性耳聾人群。藥物性耳聾基因的篩查能達到查出1人，預警10人的效果。

4 結 論

新生兒行遺傳性耳聾基因檢測具有重要而深遠的意義，本研究發現，內蒙古自治區4種常見耳聾基因20個位點突變率(總突變率為5.51%)略高于全國(總突變率為4.98%)和我國其他地區突變率，下一步考慮在本地區將新生兒篩查數擴大，再統計遺傳性耳聾基因突變率，觀察是否有下降趨勢。新生兒遺傳性耳聾基因檢測在內蒙古自治區持續推廣非常必要。