翻譯起始因子 eIF3A 調控喉癌順鉑敏感性的試驗研究

郭龍梅，徐雪媚，蔡勛功，趙 東，周 彬

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院 耳鼻咽喉科，黑龍江 哈爾濱150001)

順鉑是喉癌化療中的常用藥物，然而眾多的患者存在耐藥現象，尋找藥物敏感性的分子標志物對臨床治療具有重要意義[1]。已有研究發現翻譯起始因子 eIF3A 可能與頭頸部腫瘤細胞的順鉑敏感性有關[2]，在本研究中我們驗證其對喉癌細胞順鉑敏感性的調節作用，探討其作為順鉑敏感性分子標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

BPN紅外CO2細胞培養箱(成都泰盟科技有限公司)、721型分光光度計(成都泰盟科技有限公司)、ABI 3900臺式DNA合成儀(美國應用生物科技公司)、ABI 9700 PCR儀(美國應用生物科技公司)、ABI 7500全自動熒光定量PCR儀(美國應用生物科技公司)、光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)等。

1.2 主要試劑及藥品

順鉑(齊魯制藥有限公司；批號：040806)、MTT(sigma公司)、DMSO(sigma公司)、DEPC(南京建成生物工程研究所)、Trizol(南京碧云天生物科技公司)、dNTPs(南京碧云天生物科技公司)、MMLV(南京碧云天生物科技公司)、Taq酶(北京奧科生物科技公司)、TUNEL原位末端標記檢測試劑盒等。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞的分組及處理 喉癌Hep-2細胞分為處理組及對照組，處理組細胞過表達eFI3A，處理方法如下：(1)克隆eIF3A CDs區克隆到慢病毒載體pLVSIN CMV Puro上。(2)將構建好的穿梭質粒與包裝質粒同時轉染293T包裝細胞獲得過表達eFI3A的慢病毒以及對照空病毒。(3)利用制備好的慢病毒感染Hep-2細胞24 h后換液，感染48 h后添加適量嘌呤霉素進行穩轉eFI3A Hep-2細胞以及對照Hep-2細胞的篩選。篩選48 h后獲得的穩轉細胞株利用含嘌呤霉素(篩選濃度的一半劑量)維持培養[3]。

1.3.2細胞的培養及干預 對兩組Hep-2細胞進行同條件培養，采用1640培養液，其中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素。觀察細胞生長，去除死細胞。細胞傳代至對數生長期后采用同等量的順鉑溶液對兩組細胞進行干預，順鉑濃度為40 mg/L[4]。

1.3.3細胞生長抑制率檢測 選擇對數生長期的Hep-2細胞進行生長抑制率檢測，配備成5×104/ml的懸浮液后接種到96孔板上，細胞培養貼壁后清洗換液，加入培養基及處理液，使其濃度梯度為10、20、40、80及160 mg/L。再次培養24及48 h吸干孔中原液后加入MTT溶液，繼續培養4 h后吸取原液并于每個孔中加入二甲基礬，混勻后使用自動酶標儀于570 nm處測量a值。抑制率(fa)=(1-實驗組平均A值/空白組平均A值)×100%[5]。

1.3.4細胞總RNA提取 培養5天后從無菌室取出各組細胞并棄掉上清液，按相關流程依次加入Trizol、氯仿并孵育及離心，加入異丙醇離心后再經乙醇處理，再次離心去掉上清液得到白色沉淀，真空干燥后通過DEPC處理過的水溶解RNA，最后加入2.5倍體積的75%的乙醇溶液，在-80℃下儲存備用[6]。

1.3.5mRNA引物合成

在 GenBank上查找目的基因mRNA序列，特異性引物采用 Primer express2.0軟件進行跨內含子設計，引物的合成使用的儀器是ABI3900臺式DNA合成儀[7]，序列如下：Survivin序列(擴增片段 AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，長度129 bp),Forward primer：5′-AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3′;Reverse primer：5′-GAC AAC TGC GTC TCTG-3′。Caspase3序列(擴增片段，長度101 bp)，Forward Primer：5′-AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3′;Reverse primer 5′-TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3′。

1.3.6實時定量檢測 將上述提取的RNA用于逆轉錄反應，使用反向緩沖液、下游引物、DNPS、MMLV、DEPC等作為反應體系。進行定量PCR并依次使用標準曲線定量法、凝膠電泳法，通過測量OD260確定陽性標準并建立標準品梯度。在含有SYBR Green I PCR緩沖液、Taq酶、cDNA、ddH2O、dNTP、上游引物f及下游引物R的反應體系中對樣品及陽性標準品進行PCR反應，在各相應溫度下按相關規程共進行40個循環[8]。

1.4 統計學分析

采用SPSS17.0處理所有數據，多組符合正態分布的定量使用方差分析進行數據統計，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗進行組間比較，以P<0.05認為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 各組喉癌Hep-2細胞生長抑制情況的比較

細胞培養24 h后，處理組及對照組細胞生長抑制率分別為25.6±5.8及4.1±0.3，差異具有統計學意義(P<0.001)；細胞培養48 h后，處理組及對照組細胞生長抑制率分別為51.4±7.5及4.0±0.4，差異具有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 各組喉癌Hep-2細胞生長抑制情況

2.2 各組喉癌Hep-2細胞 Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表達情況

細胞培養5天后，處理組及對照組細胞 Caspase3 mRNA表達水平分別為1.93±0.27及0.84±0.14，差異具有統計學意義(P<0.001)；處理組及對照組細胞 Survivin mRNA表達水平分別為0.52±0.14及1.34±0.17，差異具有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 各組喉癌Hep-2細胞 Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表達

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉科較常見惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈現明顯上升趨勢，目前以手術為主的綜合療法仍是喉癌的主要治療模式[9]，化療就是其中尤為重要的輔助治療手段，而順鉑是喉癌化療中較為敏感和最為常用的藥物[10]。研究顯示在喉癌化療中無論單獨用藥或者聯合用藥、術前用藥或者是術后用藥，順鉑都表現出了良好的療效，然而也有眾多的喉癌患者表現出了對順鉑的耐藥性[11]。因此，尋找順鉑敏感性的分子標志物，增加腫瘤組織對順鉑的敏感性，對于喉癌的治療具有重大的意義。

eIF3是哺乳動物細胞中最復雜的真核起始因子，其分子量為550-700 kDa，由13個亞基組成，在細胞生長和細胞周期的調控中起重要作用[12]，eIF3A是eIF3中最大的亞基。eIF3A在人體正常組織中不表達或表達很低，而在乳腺癌、食管癌、宮頸癌、肺癌、胃癌、結腸癌等腫瘤組織中高表達，由此推測eIF3A可能與腫瘤的惡性轉化有關[13]。已有研究表明eIF3A與鼻咽癌等頭頸部腫瘤的順鉑敏感性有關[14]，在本研究中我們檢驗了其在喉癌順鉑化療中的作用。我們的研究結果顯示，相比于對照組，在eIF3A高表達的喉癌細胞株中應用順鉑后細胞增殖明顯受到抑制，說明該類細胞株對順鉑的反應性明顯增強。

Caspase3是半胱氨酸蛋白酶家族成員，又稱細胞凋亡因子，它能夠通過多種途徑促進細胞的凋亡，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的最終效應因子[15]。Survivin又稱為細胞增殖因子，它能夠通過多種途徑對細胞的凋亡及增殖進行調控，來發揮促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用，其中也包括對 Caspase-3蛋白活性的抑制[16]。這兩個因子能夠調控腫瘤的活性，因此其表達的高低能夠作為評估抗腫瘤方案敏感性的指標[17]。我們的研究結果發現，相比于對照組，處理組細胞 Caspase3 mRNA表達水平升高，Survivin mRNA表達水平降低。這說明eIF3A的高表達可能影響了Caspase-3及Survivin的活性，協同促進了喉癌細胞的凋亡，從而發揮了增加順鉑敏感性的作用，我們會在后續的試驗中對其機制進行更加深入的研究。

綜上所述，eIF3A的高表達能夠明顯增加喉癌Hep-2細胞對順鉑的敏感性，并影響了Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表達。相信隨著研究的不斷深入，eIF3A有望成為喉癌順鉑敏感性的重要分子標志物，為喉癌的化療發揮重要的指導作用。