3種分子新診斷技術與傳統培養技術檢測結核分枝桿菌陽性率比較

劉蘭瑞,張永強,張 原,馬 倩,趙鳳芹

(1.保定市第五醫院,河北 保定071000;2.保定市疾病預防控制中心)

目前，結核病疫情仍然居高不下，耐藥結核病的流行肆虐全球，其根源乃傳染源作祟，消除傳染源是控制結核病的關鍵[1]。而過去很長時間僅僅依靠痰涂片檢測，陽性發現率低。近年來，以LAMP等為代表的新診斷技術的不斷涌現為結核病的診斷提供了新的手段。本研究對活動性肺結核的患者痰標本分別采用Xpert MTB /RIF、LAMP、CPA技術和羅氏固體培養法4種在本地區常用的檢測方法進行檢測，評價4種技術在結核菌陽性檢測率方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年1-6月保定市級結核病定點醫院收治的488例活動性肺結核患者(男336 例，女152例，平均年齡42.6 歲)，每人送檢1份合格痰標本，共488份，其中涂陽標本176例，涂陰標本312例。

1.2 儀器與試劑Xpert MTB/RIF檢測儀(美國Cepheid公司)，恒溫熒光檢測儀(廣州華峰生物科技有限公司)；XpertMtb/RIF試劑盒(批號：1000147334)；、TB-LAMP 擴增試劑盒(日本榮研株式會社,批號：8Z002)；CPA檢測試劑盒(杭州優思達生物技術有限公司，批號：20181103)；酸性羅氏培養基(珠海貝索有限公司，批號：20181220)。

1.3 方法

1.3.1固體培養[2]痰標本采用NALC-NaOH前處理法，視標本性狀，加1-2倍體積的處理液于無菌痰杯中，使痰液充分液化，在20 min內接種2支酸羅氏培養基。

1.3.2LAMP檢測 經4%NaOH液痰標本預處理后12 000 r/min離心取沉淀，加DNA提取液，制備DNA模板，加入陰性對照、待檢模板和陽性對照65 ℃恒溫擴增60 min,加顯色液判讀結果，綠色為陽性，橙色為陰性。

1.3.3Xpert MTB/RIF檢測：視痰標本性狀，加入1-2 ml的Xpert MTB/RIF處理液，振蕩30 s，靜置15 min，吸取2 ml處理后的樣本加入Xpert MTB/RIF反應試劑盒中，上機檢測自動判讀。

1.3.4CPA檢測 待檢痰標本中加4%NaOH處理后靜置20 min。取1 ml液化后痰液離心棄上清。加DNA提取液，沸水浴10 min，冷卻后取上清液備用。取試劑管，加復溶液和石蠟油，室溫靜置后加入DNA模板,瞬時離心后置恒溫設備63℃擴增60 min，置核酸檢則裝置內檢測。判讀結果：檢測線和質控線同時出現，為陽性；僅出現質控線，為陰性。

1.4 統計學處理使用SPSS17.0建立數據庫進行統計學分析,率或構成比的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義,3種分子檢測的一致性評價采用Kappa檢驗。

2 結果

XpertMTB/RIF、LAMP、CPA、固體培養4種檢測方法的總陽性率依次為59.84%，58.20%，56.56%，44.06%；在涂陽患者中XpertMTB/RIF、LAMP、CPA 3種分子陽性率依次為98.86%，98.30%，97.16%，高于固體培養法94.32%；在涂陰患者中陽性率依次為37.82%，35.58%，33.65%，高于固體培養法15.71%；以上差異均有統計學意義(χ2=30.58,7.82,45.19；P<0.05)。LAMP與XpertMTB/RIF檢測的一致率為98.36%(480/488)，Kappa值=0.966；CPA與XpertMTB/RIF檢測的一致率為95.90%(468/488)，Kappa值=0.916。見表1。

表1 不同方法檢測結核分枝桿菌陽性率比較

3 討論

痰涂片染色鏡檢法及傳統固體培養法是臨床結核病檢驗中應用最普遍的方法。目前，盡管涂片和痰培養檢測MTB具有許多缺點，但涂片價格低廉且操作方便，固體培養可提供后續的藥敏試驗菌株并進行分子流行病學分析，故仍作為常規方法使用[3]。分子新診斷技術快速發展為結核菌檢驗提供了新的途徑，不僅縮短了檢測時間，而且提高了檢測效能。

病原學陽性檢出結果受多種因素影響[4]，諸如標本質量、含菌量、檢測方法靈敏性、操作熟練程度等。本研究加強了實驗前后質量控制，采取合格標本，保證標本質量，嚴格操作程序。研究顯示，痰涂片檢查陽性率僅為36.07%，固體培養法陽性率44.06%，Xpert MTB /RIF、LAMP、CPA 3種分子診斷技術表現了良好的檢測效能，陽性檢出率分別達到了59.84%，58.20%，56.56%，大大提高了陽性檢出水平。以上表明，痰涂片鏡檢法及固體培養法的靈敏度仍不及分子診斷技術。一般涂片檢查菌數需5000個/ml-10000個/ml，培養需100個/ml，標本中菌數少于此數時不易獲得陽性結果[5]。而3種分子技術只需要標本中有極微量的結核桿菌就能檢測出來。有研究CPA診斷肺結核的敏感度和特異度分別為83.33%和95.12%[6]，邱勇[7]研究CPA的敏感度與特異度分別為89.7%(95%CI:78.8%-96.1%)與92.9%(95%CI:87.7%-96.4%)。張青[8]等綜合25 篇文獻進行分析，LAMP、Xpert診斷肺結核的合并敏感度分別為93%(95% CI：92%-95% )和96%(95%CI：94%-98% ),特異度分別 88%(95%CI：85%-9O%)和98%(95%CI：98%-99%)。

Xpert MTB /RIF總陽性率高于LAMP及CPA，與Xpert MTB /RIF比較，LAMP及CPA分子檢測和Xpert MTB /RIF檢測的一致性較好，Kappa值分別為0.966和0.916。3種分子技術與培養法比較，本研究中也出現了培養陽性而分子診斷陰性的情況，LAMP檢測2例、Xpert MTB/RIF檢測2例、CPA檢測3例，可能原因有試驗所取標本中沒有結核分枝桿菌，也可能是標本中含有TaqDNA聚合酶的抑制物等[9,10]。

分子檢測技術在結核病病原學診斷中成為傳統技術的有力補充，檢出時限上，LAMP、Xpert MTB /RIF、CPA分別用時約1 h、2 h、2 h，遠小于固體培養法的30 d，3種分子技術適用于結核病的早期診斷。姜世聞[11]建議通過使用分子生物學檢測技術優化肺結核患者的篩查和診斷流程，規范實驗室操作規程，有望提高我國肺結核患者的病原學陽性檢出率。