腎癌組織中HIST1H3B的表達變化及意義

陳佳琦，孫伯堯，何成彥，岳新顏，李洪軍*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，約90%發(fā)生在腎實質[1]，發(fā)達國家和男性發(fā)病率較高，其原因尚未明確[2]。盡管腎癌較肺癌、結直腸癌等疾病發(fā)病率低，但在泌尿生殖系統(tǒng)癌癥中死亡率最高[1]，因此，早期診斷和篩查成為當前研究的重點之一，包括尿液檢查、超聲、腫瘤標志物等[3]，由于假陰性、假陽性和過度診斷的發(fā)生，使得腎癌的防治工作充滿挑戰(zhàn)。本次實驗旨在探究HIST1H3B在腎癌組織中的表達及臨床意義，為腎癌的診斷提供可能的、新的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗樣本取自吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院2018年1月到2018年12月經病理學檢查并診斷為腎透明細胞癌的患者共計18例，采集標準為：腫瘤TNM分期為Ⅲ期，同時未經化療、放療或生物治療等任何干預治療，并排除已發(fā)生遠端轉移的新鮮腎透明細胞癌組織標本，同時采集癌旁標本。將符合采集標準的樣本徹底使用生理鹽水沖洗后進行液氮冷凍，置于-80℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1提取與測定樣本總蛋白 取出冰凍保存的樣本放入PBS中清洗，并在液氮中充分研磨，完成后在已成粉末的樣本中加入適量RIPA裂解緩沖液，室溫置于冰上充分震蕩混勻，隨后加入適量RNA酶和DNA酶以去除樣本中游離的RNA和DNA，再以12 000 rmp、4℃、15 min的設定進行離心，取得的上清液即為總蛋白。提取總蛋白后進行總蛋白的測定，該過程需采用BCA蛋白定量試劑盒測定該樣本總蛋白在562 nm波長處的吸光度，根據標準曲線計算出樣本蛋白濃度。

1.2.2制備蛋白水解多肽混合物 取出妥善保存的總蛋白樣本，用5倍體積的50 mmol/LNH4HCO3溶液進行稀釋，隨后加入適量1 mol/L二硫代蘇糖醇(DTT)至溶液濃度為20 mmol/L，置于56℃避光條件下反應1 h，再冷卻至室溫并加入適量1 mol/L的碘代乙酰胺(IAM)至溶液濃度為50 mmol/L，在室溫避光條件下反應30 min。完成后在該反應體系中加入蛋白：胰酶比例為50∶1的測序級胰酶，置于37℃的水浴箱中12 h，所得產物分裝后置于-80℃冰箱保存。

1.2.3二維色譜質譜聯(lián)用技術 取出上述步驟中分裝凍存的樣品，加入0.1%FA溶液進行溶解，分裝樣品各取50 μg用于色譜上樣，再使用LTQ XL離子肼質譜儀進行蛋白質組學分析。

1.2.4免疫印跡試驗 用免疫印跡試驗分別檢測目標蛋白HIST1H3B在腎癌組織和癌旁組織的表達情況，以驗證二維色譜與質譜聯(lián)用技術的分析結果。

1.2.5儀器與試劑 PBS、苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解緩沖液、RNA酶、DNA酶、離心機、BCA蛋白定量試劑盒、NH4HCO3溶液、DTT、IAM、測序級胰酶、Agilent 1200高效液相色譜儀、伯樂垂直電泳儀、LTQ XL離子肼質譜儀、HIST1H3B單克隆抗體。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 二維色譜與質譜聯(lián)用技術分析腎癌組織和癌旁組織的結果

本次試驗中，癌組織樣本和癌旁組織樣本中同一蛋白的豐度以譜圖數的差異來衡量，同時滿足兩個樣本中蛋白譜圖數比值≥1且該對樣本譜圖數差值≥72的蛋白定義為差異蛋白。按上述定義標準，檢測出包括14個上調表達蛋白，7個下調表達蛋白，共計21個差異表達蛋白，見表1，其中目標蛋白HIST1H3B為上調表達蛋白，HIST1H3B質譜圖結果見圖1。

表1 腎癌組織及癌旁組織差異蛋白

圖1 HIST1H3B質譜圖結果

2.2 免疫印跡試驗分析HIST1H3B在腎癌和癌旁組織中的表達結果

使用免疫印跡試驗分析HIST1H3B在腎癌和癌旁組織中的表達情況，結果見圖2。結果表明HIST1H3B在腎癌組織中表達量高于其配對的癌旁組織，進一步驗證了LC-MS技術分析結果。

圖2 免疫印跡試驗分析HIST1H3B在腎癌和癌旁組織中的表達

3 討論

組蛋白家族主要包括H1、H2B、H3、和H4[4]，共同參與核小體的構成[5]。其中組蛋白H3對于維持染色體正常結構具有非常重要的意義[6]。組蛋白H3主要有H3.1、H3.2、H3.3、著絲粒蛋白-A和睪丸特異性組蛋白H3t等5種變體。組蛋白H3.1沉積在染色質中，通常依賴DNA復制，并發(fā)生在CAF-1分子伴侶介導的過程中[7]。已有研究表明，組蛋白基因在乳腺癌、肝癌中患者中均為高表達[4，8]，同時組蛋白基因可能會成為檢測乳腺癌、喉癌、宮頸癌患者生存的預后指標[4，9，10]，更有研究表明，組蛋白H3變異體的突變可能是彌漫性橋腦神經膠質瘤(DIPG)的潛在特異性治療靶標[11]，可能為相關疾病提供新的治療方向。

目前關于HIST1H3B的研究大部分與共價修飾方面有關，而關于組蛋白與癌癥的關系、組蛋白在癌癥中可能存在的作用等方面的研究較少，有待進一步探究。

近年來，我國乃至全球范圍內腎癌發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上漲的趨勢[12]，由于早期診斷和篩查的不完善，目前主要依靠影像學手段明確診斷。已有大量研究證實，DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA表達等表觀遺傳性改變在腎癌發(fā)生過程中起重要作用[12]。因此在未來科研工作中探究腎癌相關基因遺傳學方面顯得尤為重要。集合管癌(CDC)是一種罕見的腎癌亞型，預后差，Wach等人提出組蛋白基因HIST1H3B(H3.1)在集合管癌中表達上調[13]，這一研究結果可能為腎癌的早期診斷提供新的思路，但由于臨床數據有限及亞型的局限性，不能說明HIST1H3B在其他亞型腎癌中的表達情況。本研究應用二維色譜-質譜聯(lián)用技術證明了HIST1H3B在腎癌中的表達量上調，且在癌組織中表達量明顯高于其配對的癌旁組織，不排除HIST1H3B與腎癌的發(fā)生發(fā)展有關，但具體機制尚未完全明確，仍需進一步研究。