丙泊酚抑制Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的EMT降低乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的機(jī)制

吳海洋

(棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院 普外科,山東 棗莊277100)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，我國近些年乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，其死亡率居于女性惡性腫瘤首位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。目前對乳腺癌的研究主要集中于分子機(jī)制方面。丙泊酚(propofol)又稱為異丙酚，是一種短效、快速的靜脈麻醉藥，近些年的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可影響多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移及凋亡，如丙泊酚對人肺癌A549細(xì)胞的生長和遷移有明顯的抑制作用，且可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)AQP1蛋白表達(dá)有關(guān)[2]。乳腺癌中的研究表明，丙泊酚可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但機(jī)制尚未明確[3，4]。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，也稱為Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞發(fā)育等過程中被激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[5,6]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)致癌的關(guān)鍵是β-catenin在細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)積累，β-catenin的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生相關(guān)，cyclinDl和c-myc是Wnt信號(hào)非常重要的靶基因[7]。研究表明，EphA2siRNA能夠逆轉(zhuǎn)Wnt信號(hào)激活劑LiCl誘導(dǎo)的胃癌AGS細(xì)胞EMT，降低發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的胃癌AGS細(xì)胞的侵襲力[8]；FL118抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的機(jī)制與Wnt通路有關(guān)[9]。本研究試圖證實(shí)丙泊酚是否可通過抑制Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的EMT降低乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、FBS、青鏈霉素均購自美國Gibco；抗β-catenin、cyclinDl、c-myc、E-cadherin、vimentin和N-cadherin抗體均購自美國CST；MTT、DKK-1人重組蛋白和LiCl購自美國Sigma；Transwell小室試劑盒購自美國Corning；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD。酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自美國ATCC。細(xì)胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于5% CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)為生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2丙泊酚對Wnt信號(hào)及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 收集40 μmol/L的丙泊酚處理48 h的MDA-MB-231細(xì)胞，加適量細(xì)胞裂解液于冰上反應(yīng)30 min，離心，收集上清，BCA法測定上清中蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加5× SDS-PAGE上樣緩沖液，于沸水中煮沸變性5 min，取變性蛋白，每孔道上樣等量(30 μg)，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，分離后的蛋白依次經(jīng)PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，加皆為1∶500稀釋的抗β-catenin、cyclinDl、c-myc、E-cadherin、vimentin和N-cadherin抗體，4 ℃搖床孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II抗，室溫孵育2 h，洗滌，ECL顯示，曝光，Quantityone軟件測定灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值為各蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.3Wnt信號(hào)抑制劑DKK-1及激活劑LiCl對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響 以5×103/孔的細(xì)胞濃度接種生長至對數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞于96孔板，每孔100 μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用100 ng/mL的DKK-1及20 mmol/L的LiCl處理MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞無特殊處理的為空白對照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，處理48 h后加MTT，每孔20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加DMSO，每孔150 μl，震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值(A值)。

1.2.4DKK-1或LiCl對MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 收集100 ng/mL的LiCl及20 mmol/L的LiCl處理48 h的MDA-MB-231細(xì)胞，參照方法1.2.2檢測E-cadherin、vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)。

1.2.5丙泊酚激活或抑制Wnt信號(hào)對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 MDA-MB-231細(xì)胞分為對照組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、丙泊酚組(40 μmol/L的丙泊酚處理細(xì)胞48 h)、丙泊酚+DKK-1組(40 μmol/L的丙泊酚及100 ng/mL的LiCl處理細(xì)胞48 h)和丙泊酚+LiCl組(40 μmol/L的丙泊酚及20 mmol/L的LiCl處理細(xì)胞48 h)。采用transwell小室檢測。Transwell小室預(yù)先鋪Mateigel基質(zhì)膠，Transwell小室的上室中加按照上述分組處理后制備的細(xì)胞懸液(100 μl)，下室中加入500 μl含10% FBS的培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃恒溫常規(guī)孵育24 h，棉簽輕拭去上室底部細(xì)胞，4%多聚甲醛及0.1%結(jié)晶紫染色后，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下(×200)侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，取均值。檢測細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)的分組處理及實(shí)驗(yàn)方法同上，區(qū)別在于未鋪Mateigel基質(zhì)膠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對MDA-MB-231細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示，丙泊酚處理后的MDA-MB-231細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、cyclinDl和c-myc的蛋白表達(dá)均明顯降低，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 丙泊酚對MDA-MB-231細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、cyclinDl和c-myc蛋白表達(dá)的影響

2.2 丙泊酚對MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，丙泊酚可上調(diào)與EMT相關(guān)的E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 丙泊酚對MDA-MB-231細(xì)胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

2.3 Wnt信號(hào)抑制劑DKK-1及激活劑LiCl對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，Wnt信號(hào)抑制劑DKK-1可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的活力，而其激活劑LiCl可增加細(xì)胞活力，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 Wnt信號(hào)抑制劑DKK-1及激活劑LiCl對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

2.4 DKK-1對MDA-MB-231細(xì)胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，DKK-1可上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 LiCl對MDA-MB-231細(xì)胞E-cadherin、Vim-entin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，LiCl可下調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，上調(diào)vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 DKK-1或LiCl增加或降低丙泊酚對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用

Transwell小室檢測的各組細(xì)胞侵襲及遷移能力檢測結(jié)果如圖6所示，丙泊酚組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)，而丙泊酚+DKK-1組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)顯著低于丙泊酚組，丙泊酚+LiCl組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)顯著高于丙泊酚組(P<0.05)。

圖6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲及遷移能力的變化

3 討論

腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程較為復(fù)雜，受多種蛋白和基因的調(diào)控，目前對多數(shù)實(shí)體腫瘤的主要治療手段是手術(shù)切除，但難以避免術(shù)后的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[10,11]。作為腫瘤切除手術(shù)常用的靜脈麻醉藥，丙泊酚對腫瘤的影響受到廣泛關(guān)注。有研究表明，丙泊酚可通過抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)降低肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[12]；可通過減少Slug表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲及遷移能力[13]；可通過下調(diào)microRNA-221抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[14]。以上研究表明，丙泊酚可通過不同途徑抑制不同腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞在特定的生理病理情況下向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。其生物學(xué)過程非常復(fù)雜，涉及多個(gè)步驟及多個(gè)基因，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15,16]。對大多數(shù)腫瘤來說，在其向惡性發(fā)展過程中經(jīng)常伴隨有細(xì)胞向上皮分化功能的喪失，進(jìn)而朝間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)化，而有EMT發(fā)生更易促進(jìn)細(xì)胞的侵襲及遷移[17,18]，因此，EMT在惡性腫瘤侵襲和遷移中的作用已成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt、Notch、MAPK等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與腫瘤細(xì)胞EMT過程[19,20]。Wnt信號(hào)是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲遷移等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，在多種腫瘤中Wnt信號(hào)被異常激活，Wnt信號(hào)激活后可使β-catenin在胞質(zhì)中大量聚集，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，最終激活下游cyclinDl和c-myc等的過度表達(dá)，影響細(xì)胞的生物學(xué)特性[21,22]。有研究顯示，SHP2E76K和SHP2WT可通過Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和誘導(dǎo)EMT[23]。Raptor能通過Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[24]。

E-cadherin的丟失或減少是EMT最重要的標(biāo)志，細(xì)胞中許多轉(zhuǎn)錄因子和生長因子如vimentin、N-cadherin、Twist1等的過表達(dá)也可誘導(dǎo)EMT，進(jìn)而提高腫瘤的侵襲及遷移能力[25]。丙泊酚可通過抑制Wnt/β-catenin通路，下調(diào)轉(zhuǎn)移瘤組織中E-cadherin和β-catenin的表達(dá)，從而抑制MADB106細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移[26]。丙泊酚可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)vimentin、N-cadherin、p-p38等表達(dá)和降低HDACs活性，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞侵襲遷移及EMT過程[27]。

本研究結(jié)果顯示，丙泊酚可抑制Wnt信號(hào)β-catenin、cyclinDl和c-myc的蛋白表達(dá)。上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)vimentin和N-cadherin表達(dá)。提示丙泊酚可抑制Wnt信號(hào)及EMT過程。Wnt信號(hào)抑制劑DKK-1及激活劑LiCl處理乳腺癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)DKK-1可上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)vimentin和N-cadherin表達(dá)，而LiCl可下調(diào)E-cadherin表達(dá)，上調(diào)調(diào)vimentin和N-cadherin表達(dá)，這提示抑制Wnt信號(hào)可抑制EMT過程，激活Wnt信號(hào)可促進(jìn)EMT過程。細(xì)胞侵襲及遷移檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力，聯(lián)合DKK-1對細(xì)胞侵襲遷移能力抑制更明顯，而聯(lián)合LiCl可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲及遷移能力。提示丙泊酚可通過抑制Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的EMT降低乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力。

綜上所述，丙泊酚可抑制Wnt信號(hào)和EMT過程，抑制Wnt信號(hào)可減弱EMT，而激活Wnt信號(hào)可增加EMT，丙泊酚可通過抑制Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的EMT降低乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力。該研究可能為丙泊酚對乳腺癌細(xì)胞影響的機(jī)制研究提供了一定的理論依據(jù)。