MicroRNA-146b在大鼠腎間質纖維化模型中的表達及意義

王藝璇，趙冠杰，辛光大

(吉林大學中日聯誼醫院 腎內科，吉林 長春130033)

慢性腎臟病是一種嚴重危害人類生命健康的“全球公共健康問題”，而腎間質纖維化是多種慢性腎臟病進展為終末期腎臟病的共同途徑和最可靠的預測因子[1]。目前，進一步探索腎間質纖維化的發病機制，以利于延緩腎間質纖維化的進展已經成為國內外研究的熱點。

MicroRNA-146b位于10號染色體，是炎癥反應的調節因子[2,3]。有研究表明microRNA-146b在肝纖維化和心肌纖維化的發病機制中發揮作用[4,5]，但尚未有文獻報道其在腎間質纖維化的發生、發展中的作用。本研究通過在大鼠腎間質纖維化模型中觀察腎間質纖維化的嚴重程度與MicroRNA-146b的表達變化，探討microRNA-146b在腎間質纖維化發生、發展中的意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組與造模

SPF級健康成年雄性SD大鼠20只，體重約180-210 g,購買并飼養于吉林大學實驗動物中心。隨機分為Sham組和UUO組，每組10只，各組再隨機分為7 d、14 d兩個亞組。各組大鼠于手術處理前12 h禁食、不禁水，乙醚麻醉后大鼠俯臥位固定于手術臺上，Sham組大鼠開腹后游離左側輸尿管，但不結扎，分層縫合關腹。UUO組開腹后于左腎下極處游離并結扎左側輸尿管，分層縫合關腹。分別于術后7天、14天處死相應大鼠，收集左側腎臟。

1.2 腎組織病理學檢查

部分腎臟組織10%福爾馬林固定后石蠟包埋，后制成4 μm的切片，行HE和masson染色。在光鏡下進行腎間質損傷及纖維化的半定量評分。每張切片隨機選取10個非重復視野，在光鏡(×200)下觀察。腎間質損傷評分按照腎小管萎縮、腎小管壞死、間質纖維化和淋巴細胞浸潤4個參數進行評分[6]。前3個參數 按 0—3分評定，0：正常；1：輕度受損,病變范圍<25%；2：中度受損,病變范圍 25%-50%；3：重度受損，病變范 圍>50%。淋巴細胞浸潤也按0-3分評定，0：正常；1：輕度局限；2：輕度彌散或中度局限；3：重度彌散。4個參數得分相加為每個樣本小管間質損傷評分，參數間質纖維化即為纖維化評分。

1.3 腎組織TGF-β1免疫組織化學表達

大鼠腎組織石蠟切片常規脫蠟，梯度乙醇脫水,抗原修復后加入3% H2O2室溫靜置15 min孵育。山羊血清室溫孵育15分鐘，一抗加入抗 TGF-β1(1∶200),4 ℃孵育過夜，HRP標記二抗。DAB 顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。在光鏡(×400倍)下觀察,每張切片隨機選取6個不重復視野。應用Image Pro Plus 圖像分析軟件計算累積光密度(integrated optical density，IOD)，取其平均值進行統計學分析。

1.4 RT-PCR檢測腎組織中MicroRNA146b表達

分別取各組大鼠腎組織 100 mg,樣本進行總 RNA 提取,并測定濃度,按照PrimeScriptTMRT reagent kit(TaKaRa,Japan) 說明書方法逆轉錄合成 cDNA 模板。qRT-PCR采用SYBR Green法，以GAPDH為內參。MicroRNA146b 正向引物：5’-GAGAACTGAATTCCATAGGCT-3’，反向引物:5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH正向引物:5’-ATGTTTGTGATGGGTGTGAA-3’，反向引物:5’-ATGCCAAAGTTGTCATGGAT-3’。反應體系為cDNA模板1 μl；上下游引物(10 μM) 各0.5 μl；SYBR GREEN mastermix 10 μl；用ddH2O補足至20 μl。反應條件為 94.0℃，2 min預變性； 94.0 ℃，15 s變性； 60.0 ℃，15 s退火；72.00 ℃，15 s延伸。所有樣品均作3個復孔。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠病理組織學變化

Sham組(7 d和14 d)大鼠腎小管形態正常，結構清晰，偶見腎小管上皮細胞壞死及淋巴細胞浸潤，無腎小管萎縮，可見微量膠原纖維。UUO 組術后7天，部分腎小管上皮細胞空泡變性或壞死脫落，部分腎小管擴張或灶狀萎縮，間質增寬，灶狀淋巴細胞浸潤，可見膠原纖維沉積。病理評分比7dSham組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)。術后14天，腎小管片狀萎縮及壞死，淋巴細胞廣泛浸潤，腎間質明顯增寬，大量膠原纖維沉積。病理評分較14dSham組和7dUUO組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。(見圖1、表1)。

圖1 各組大鼠病理組織學形態(×200)

表1 各組大鼠腎病理組織學評分

2.2 各組大鼠腎臟組織TGF-β1免疫組織化學表達

Sham組大鼠腎組織可見微量 TGF-β1 表達，UUO 組7 d 和 14 d 大鼠腎臟組織TGF-β1的累計光密度均較同時間點 Sham 組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05);并且UUO組14 d大鼠腎組織TGF-β1的累計光密度較7d增高，差異有統計學意義(P<0.05)。(見圖2、表2)

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1表達水平(×400)

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1表達水平

2.3 各組大鼠腎組織MicroRNA146b表達水平

Sham組術后第7天、14天腎組織MicroRNA-146b表達水平明顯低于相應UUO組，差異有統計學意義(P<0.05)。并且7dUUO組大鼠MicroRNA-146b表達水平明顯低于14dUUO組，差異有統計學意義(P<0.05)。(見表3)

表3 各組大鼠腎組織MicroRNA146b表達水平

2.4 相關性分析

腎組織 MicroRNA-146b與腎間質損傷、腎纖維化程度及TGF-β1表達水平呈正相關(r=0.858、0.765、0.647,P<0.01)。

3 討論

腎纖維化以腎間質成纖維細胞的增生、細胞外基質的過度積聚，以及腎單位萎縮消失等為主要病理特點[7]，是多種不同類型腎臟損傷進展為終末期腎臟病的共有病理改變[8]。也是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后的主要指標[9]。其發生機制涉及炎癥、凋亡、氧化應激及多種細胞因子作用等方面。 目前研究表明,慢性持續性炎癥促進腎間質纖維化的形成，是慢性腎病進展的重要機制[10]。

MicroRNA-146b 是 miR-146家族中的一員,主要調節炎性反應，通過參與靶基因轉錄后的表達和調控，在人體固有免疫、腫瘤侵襲轉移、肝纖維化、心肌梗死及急性腎損傷等多種疾病中發揮重要作用[4，11-16]。在本研究中腎臟病理組織學及免疫組織化學結果顯示UUO組大鼠出現腎間質損傷及纖維化，并且隨著造模時間延長，腎間質損傷及纖維化程度加重。而且，UUO組大鼠腎組織中 microRNA-146b表達上調,并與腎間質損傷及纖維化程度呈正相關,提示 microRNA-146b參與了腎纖維化的進展，這與我們之前的研究結果一致[17]。

近年研究表明KLF4是MicroRNA-146b調控的靶基因之一，它是一種鋅指蛋白，microRNA-146b通過靶向其3′-UTR抑制了KLF4的表達。而KLF4可抑制Smad2/3與α-SMA啟動子的結合，降低α-SMA的表達[18,19]，是TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT的抑制因子。下調的KLF4減弱了其對TGF-β1/smad通路的抑制作用，促進了纖維化的進展。本研究也觀察到MicroRNA146b與TGF-β1具有相關性。我們推測microRNA-146b通過KLF4參與了TGF-β1/smad通路的調控，促進了腎纖維化的進展，這需要進一步的實驗進行驗證。

綜上所述,隨著腎纖維化程度加重，UUO組大鼠腎組織中 microRNA-146b表達上調,且具有正相關性，提示microRNA-146b對腎纖維化的發生、發展起促進作用。該作用可能是microRNA-146b通過KLF4參與了TGF-β1/smad通路的調控，促進了腎纖維化的進展，尚需要進一步實驗研究明確MicroRNA-146b在腎纖維化中的作用機制，以利于進一步尋找預測及診斷慢性腎臟病的新型標志物及治療靶點。