外泌體中miR-223的表達對胃癌細胞的生物學影響

王 寧，付立業，隋承光，孟凡東，李 妍*

(1.沈陽市第六人民醫院 腫瘤介入綜合治療科，遼寧 沈陽110006；2.中國醫科大學附屬第一醫院 腫瘤研究所，遼寧 沈陽110001)

微小RNA(miRNA)具有調節基因表達的能力，通過與靶mRNA結合調控基因表達。miRNA的檢測被廣泛應用于惡性腫瘤的診治[1]。miRNA-223(miR-223)高度保守，既可以作為致癌基因也可以作為抑癌基因在多種腫瘤中發揮作用，miR-223通過靶向調控腫瘤細胞中不同基因的表達及其下游信號通路，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移及耐藥性等生物學行為。miR-223作為致癌基因還是抑癌基因參與胃癌的生物學功能，目前研究甚少。本文研究血清外泌體miR-223與胃癌相關基因表達的相關性，進一步探討miR-223在胃癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年12月中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科收治的100例確診胃癌患者(病例組)，均未接受放、化療等治療；其中男59例，女41例；年齡25-75歲，平均(48.54±10.11)歲。另選取50例健康志愿者(健康對照組)以及50例良性胃病患者(良性疾病對照組)。健康對照組中男26例，女24例；年齡25-65歲，平均(44.23±9.03)歲。良性胃病患者男28例，女22例；年齡20-73歲，平均(47.22±11.13)歲。3組性別構成比和年齡比，差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.1.2樣本采集

采集患者及健康志愿者外周靜脈血(5 ml/人)，置于抗凝真空管中，離心留取上清液-80℃保存，待后續實驗，采用外泌體試劑盒對剩余血液進行血清外泌體提取。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測研究對象血清外泌體中miR-223的表達水平 Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄cDNA，反應體系為70℃ 10 min，42℃ 60 min，72℃ 15 min，擴增40個循環，每個標本3個復孔。miR-223上游：5′-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3′，下游：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′。

1.2.2外周血細胞因子檢測

ELISA法檢測患者及對照組外周血中IGF-1R的表達，依據說明書進行。

1.2.3細胞轉染

將處于對數生長期的胃癌MKN-28細胞消化后，接種于6孔細胞培養板中，細胞數為5×105/孔。當細胞生長達到40%-50%時，根據Lipofectamine 2000脂質體說明書進行操作，分別將microRNA空白序列(miR-223 NC，NC組)及miR-223模擬物(miR-223 mimic，miR-223 mimics 組)按終濃度為50 nmol/L轉染到胃癌MKN-28細胞。細胞轉染24h后，應用RT-PCR法檢測細胞的轉染效率及細胞中miR-223的表達。

1.2.4增殖及侵襲相關基因表達的檢測

采用RT-PCR對胃癌細胞增殖及侵襲相關基因進行檢測。方法同1.2.1。miR-223引物序列，上游：5′-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3′，下游：5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；PTEN引物序列，上游：5′-ACACGACGGGAAGACAAGTT-3′，下游：5′-TCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3′；β-catenin引物序列，上游：5′-AAGTTC TTGGCTATTACGACA-3′，下游：5′-ACAGCACCTTCAGCACTCT-3′；N-cadherin引物序列，上游：5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3′，下游：5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAG-3′；E-cadherin引物序列，上游：5′-TCCATTTCTTGGTCTACGCC-3′，下游：5′-CACCTTCAGCCAACCTGTTT-3′；GAPDH引物序列，上游：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游：5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。PCR反應條件：預變性94℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火53℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，擴增40個循環周期，最后延伸72℃ 10 min。每個樣本檢測3個復孔。

1.3 統計學分析

采用SPSS22.0軟件對數據進行分析處理，計量資料用均數±標準差表示，組間數據的差異采用單因素方差分析進行比較，Pearson相關分析檢驗兩變量之間的相關性。P<0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組人群血清外泌體中miR-223和IGF-1R的表達

胃癌患者血清外泌體中miR-223的表達明顯低于良性胃病患者和健康對照組(P<0.05)；血清中IGF-1R的表達明顯高于良性胃病患者和健康對照組(P<0.05)，如圖1。

圖1 血清外泌體中miR-223和IGF-1R的表達水平

2.2 miR-223的表達與胃癌分期的相關性

比較不同TNM分期胃癌患者血清中miR-223的表達水平，結果顯示Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者血清中miR-223的表達水平明顯低于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，且差異有顯著的統計學差異(圖2)。

圖2 血清中miR-223的表達水平與胃癌分期的相關性

2.3 胃癌細胞系MKN-28中miR-223的表達

采用RT-PCR方法檢測細胞中miR-223的轉染效率，結果顯示，與空白對照組和miR-223 NC組相比，轉染miR-223后的MKN-28細胞中miR-223的表達顯著增加，且差異有統計學意義(P<0.05)，如圖3。

圖3 胃癌細胞系MKN-28中miR-223的表達水平

2.4 胃癌細胞中PTEN的表達

為驗證miR-223對胃癌細胞增殖的影響，采用RT-PCR檢測各組胃癌細胞中增殖基因PTEN的表達，結果顯示，miR-223組中PTEN的表達明顯高于miR-223 NC組(P<0.05)和Control組(P<0.05)，表明miR-223可以上調PTEN的表達，進而抑制胃癌細胞的增殖(圖4)。

圖4 胃癌細胞中增殖基因PTEN的表達水平

2.5 胃癌細胞中侵襲基因的表達

為驗證miR-223對胃癌細胞上皮間質轉化及侵襲的影響，采用RT-PCR法檢測相關基因的表達，結果顯示，miR-223組中β-catenin、N-cadherin和E-cadherin的表達水平均高于miR-223 NC組(P<0.05)和Control組(P<0.05)，揭示miR-223的過表達可抑制胃癌上皮間質轉化(圖5)。

3 討論

miR-223在多種腫瘤細胞和組織中高表達，與腫瘤的惡性程度有一定相關性[2]。miR-223通過與腫瘤靶基因及相關信號通路作用，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移侵襲等生物學過程。

圖5 胃癌細胞中侵襲基因的表達水平

外泌體(exosomes)具有傳遞細胞間信號的作用[3]。研究表明，胰腺炎大鼠模型腺泡細胞外泌體中含有大量的miRNAs，參與激活肺泡巨噬細胞，調節炎癥反應，可見，外泌體攜帶的miRNA一定程度可以反映細胞的病理狀態[4]。為研究miR-223在胃癌中的作用，本實驗檢測了血清外泌體中miR-223和IGF-1R的含量，顯示，胃癌患者miR-223的表達明顯低于良性胃病患者和健康對照組；IGF-1R的表達明顯高于良性胃病患者和健康對照組，且miR-223和IGF-1R的含量呈負相關。

胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)是miR-223的一個靶點。miR-223在肝癌患者血清及組織中低表達，而過表達miR-223后，肝癌細胞的增殖明顯受到抑制，但其凋亡率增加，同時導致IGF-1R的表達下降[5]。過表達的miR-223通過抑制PI3K/Akt/S6信號通路，還可以增強非小細胞肺癌對厄洛替尼的敏感性，從而抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡[6,7]。這也表明，同一腫瘤細胞中miR-223可以同時調控多個靶點，發揮不同作用。

低表達的PTEN可以引起多種腫瘤的發生，負向調節PI3K/AKT信號通路活性，促進細胞增殖。為驗證miR-223對胃癌細胞增殖的影響，本實驗設計了miR-223過表達細胞組，miR-223 NC組和Control組，結果miR-223過表達中PTEN的表達明顯高于其他兩組，表明PTEN作為新發現的與腫瘤關系密切的抑癌基因[8]，miR-223可以通過上調PTEN的表達，抑制胃癌細胞增殖。研究發現，過表達的miR-223與胃癌患者的預后成負相關，miR-223通過下調腫瘤抑制因子EPB41L3的表達，促進細胞的侵襲轉移[9]。乳腺癌細胞中miR-223 通過調控FOXO-1的表達，促進細胞的增殖[10]。表明高水平的miR-223與腫瘤侵襲有關，且能促進腫瘤細胞增殖。

miR-223參與調控多種腫瘤細胞的生理過程[11]。上皮-間質轉化(Epithelial-stromal transformation，EMT)過程可以導致腫瘤細胞遷移及侵襲能力增強。本實驗分析了上皮間質轉化相關基因的表達，結果顯示，miR-223組中β-catenin、N-cadherin和E-cadherin的表達均高于miR-223 NC組和Control組，揭示胃癌細胞miR-223過表達可抑制胃癌上皮間質轉化。EMT過程中，通過切斷E-cadherin介導的細胞黏附，誘導N-cadherin的表達和釋放β-catenin[12]。

E-cadherin表達降低或缺失可導致上皮細胞間黏附能力的減弱或丟失[13]。β-catenin可與E-cadherin結合共同參與細胞間的黏附，當調節β-catenin的系統失調時，胞漿內游離狀態的β-catenin即可參與Wnt信號途徑的作用[14]。胃癌發生發展中，E-cadherin與β-catenin的表達也相應出現異常改變[15]。E-cadherin表達減少或丟失是細胞失分化的一種危險因素，也是判定患者預后不良的標志，更是腫瘤侵襲轉移的重要原因之一[16]。腫瘤細胞中β-catenin基因突變還可使β-catenin與E-cadherin的結合位點發生異常，不能形成E-cadherin/β-catenin復合體，進而使β-catenin從細胞膜脫離而游離到細胞漿中。

目前，對miR-223的研究日漸增多，明確miR-223在胃癌中的調控機制，將為胃癌患者尋找新的治療靶點提供更可靠的理論依據。