斷裂點精確定位在平衡易位胚胎染色體分析中的應用

王珺，茍興慶，王茜怡，王曉紅*，張碩

(1.空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710038；2.復旦大學婦產科醫院集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

染色體平衡易位的新生兒出生率約為1/2 000，平衡易位是染色體結構異常中最常見的畸變類型[1-2]。平衡易位患者在生育年齡前通常無明顯臨床癥狀，但其生殖細胞在減數分裂過程中會大概率產生多種比例的不平衡配子，精子和卵母細胞結合后無法產生正常的二倍體胚胎，從而導致出現反復性流產、胚胎發育停止、胎兒畸形和晚期新生兒缺陷等不良妊娠結局[3-5]。同時，在胚胎發育過程中由于非姐妹染色體單體之間或同一染色體上含有同源序列的脫氧核糖核酸(DNA)分子，DNA分子間/內重新組合形成同源重組，這些同源重組的存在將會對染色體是否易位的判斷造成影響。

在過去幾年中，有許多學者嘗試使用顯微切割和二代測序、等位基因映射識別、單體型連鎖分析(PGH)雙端測序和長讀長測序來獲得平衡易位斷裂點的精確定位，隨后通過靶向PCR-Sanger測序技術精準定位到斷裂點或基于斷裂點的單核苷酸多態性(SNP)位點進行連鎖分析，鑒定完全正常的胚胎[6-11]。但是，在高度重復和可變易位區域中確定精確斷點仍然不穩定且不準確。

本研究針對兩例染色體平衡易位攜帶同胞兄弟，利用基因芯片測序結合熒光強度比(LRR)、B等位頻率(BAF)、PGH和基因型識別兩對夫婦、男方母親及胚胎的染色體結構。該方法盡可能縮小斷裂點區域，精確判斷染色體拷貝數結果，加之對單體型結果的評判，更準確的篩選染色體完全正常的胚胎，為改進并完善染色體結構變異檢測技術提供可能。

資料與方法

一、研究對象

本研究中兩對平衡易位攜帶夫婦(夫婦A、B)來自陜西省空軍軍醫大學唐都醫院生殖醫學中心。詳細家系圖見圖1。患者夫婦A中的男方(Ⅱ4)為哥哥，患者夫婦B中男方(Ⅱ5)為弟弟，兄弟二人均已婚且婚后4年均未行避孕措施，其雙方配偶(Ⅱ3和Ⅱ6)于2018年11月因原發性不孕癥就診。細胞遺傳學檢查發現，兩對夫婦中的女方(Ⅱ3和Ⅱ6)均為原發性不孕癥，兩對夫婦中的男方(Ⅱ4和Ⅱ5)均為平衡易位攜帶者，染色體平衡易位均為46，XY，t(14；16)(q24；p13.3)，經男方父母核型驗證，兄弟二人平衡易位均為母源變異遺傳。該兩對夫婦簽署了知情同意后進行胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)，該研究方案得到空軍軍醫大學唐都醫院倫理委員會的批準。

Ⅱ3(哥哥妻子)和Ⅱ4(哥哥)為夫婦A；Ⅱ5(弟弟)和Ⅱ6(弟弟妻子)為夫婦B圖1 平衡易位家系圖

二、促排卵和胚胎培養

兩對夫婦均采用短效長方案促排卵，當3個主導卵泡直徑≥18 mm時，肌肉注射250 mg人絨毛膜促性腺激(HCG)(艾澤，默克，美國)，36 h后經陰道取卵。獲卵后經培養39～40 h行卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)，待胚胎發育到囊胚期116～144 h(D5～D6)根據評估標準Gardner[12]評估胚胎質量，所有胚胎冷凍保存。

三、芯片檢測

分別抽取兩對夫婦及男方母親(I2)各5 ml外周血放入抗凝管(三力醫用科技發展有限公司)，并嚴格按照血液和組織抽提試劑盒(DNeasy，QIAGEN，德國)說明書提取DNA。胚胎發育第5天取其滋養外胚層中5～10個細胞置于0.2 ml EP管中，根據胚胎細胞制備試劑盒(REPLI-g Single Cell DNA Library Kit，QIAGEN，德國)說明書裂解細胞，并通過多重置換擴增技術(MDA)進行全基因組擴增(WGA)，在恒溫30℃擴增8 h，后在65℃條件下滅活3 min。擴增過程中設置陰陽性對照，其中陰性對照為4 μl胚胎培養過程中的空白培養液，陽性對照為細胞系(GM16457，科里爾醫學研究所NIGMS人類遺傳細胞庫，美國)分離的5～10個細胞。根據芯片檢測試劑盒說明書(Illumina HumanKaryomap-12 DNA Analysis Kit，Illumina，美國)對分離的DNA和WGA產物進行處理，采用Illumina Human Karyomap-12芯片V1.0進行檢測，再使用Illumina iScan Bead Array Reader對其進行掃描。

四、染色體的拷貝數變異(CNV)分析

采用Genome Studio軟件和Karyo Studio軟件(Illumina)處理微陣列掃描數據以分析CNV。基于二元高斯分布構建14種LRR和BAF模型，用于識別拷貝數異常的基因組區域[13-14]。在正常樣本中，每個位置的離散BAF應該在0、0.5和1(分別對應于0/0、0/1、1/1三種基因型)，LRR應該為0，偏離期望位置則表示拷貝數異常。

五、PGH分析

若平衡易位為遺傳型，則以平衡易位攜帶者的攜帶型親本為參考，尋找攜帶型親本為純合基因型、平衡易位攜帶者為雜合基因型的SNPs，判斷出平衡易位攜帶者的易位單體，同時要滿足平衡易位攜帶者為雜合基因型、其配偶為純合基因型的SNPs，判斷出胚胎是否攜帶平衡易位；若平衡易位為新發型或胚胎中存在不平衡易位相關的拷貝數變異，可以尋找平衡易位攜帶者為雜合基因型及其另一半為純合基因型的有效SNPs，用于確定易位攜帶鏈的單體型。

六、精確斷裂點

結合CNV、單體型與胚胎基因型三種分析方法，明確易位斷裂點所在區域。CNV分析基于Karyo Studio軟件分析BAF與LRR的分布來確定CNV斷點；PGH基于家系中有效SNPs進行分型，不能正確分型的區域則考慮可能存在CNV；存在拷貝數異常的胚胎，其缺失區域內位點應該完全為純合基因型。綜合以上多方面的指標，分析各胚胎的斷裂點區域，并確定染色體結構為不平衡易位型(指在易位相關染色體存在CNV)、易位攜帶型(指易位相關染色體不存在CNV，但其為平衡易位攜帶者)或正常型(指易位相關染色體結構正常，不攜帶平衡易位)。

七、胚胎植入與產前診斷

綜合評估兩對夫婦所有胚胎的單體型結果、染色體結果和胚胎形態學結果(囊胚期胚胎評估標準參考Gardner[12]標準)，優先選擇染色體正常型且形態學評分較高(4AA>4AB>4BA>4BB，若滋養外胚層和內細胞團細胞數目較少，胚胎質量評分由“4BB”降為“4B-B-”)的胚胎復蘇，經知情同意分別植入母體，于孕中期(17～22+6周)，行羊水穿刺胎兒染色體G顯帶核型分析，再次確認PGH胚胎檢測結果。

結 果

一、促排卵結局

在采用短效長方案促排卵后，夫婦A中的女方(Ⅱ3)共獲卵15枚，ICSI后正常受精13枚，達到活檢標準胚胎6枚(1-1、1-3、1-5、1-6、1-7和2-2號胚胎)；夫婦B中的女方(Ⅱ6) 獲卵14枚，ICSI后正常受精12枚，達到活檢標準胚胎9枚(1、2、3、4、5、7、8、9和10號胚胎)，對活檢合格的胚胎進行PGH檢測并凍存。

二、精確平衡易位斷裂點

1.CNV分析結果：平衡易位攜帶者中14號染色體的斷點約在chr14：70 000 000(±3 Mb)附近。其中，染色體正常拷貝數為2，夫婦A中有2枚胚胎(1-1和1-7號胚胎)在平衡易位相關的14號染色體斷點下游拷貝數為3，有1枚胚胎(2-2號胚胎)在14號染色體斷點下游拷貝數為1；夫婦B中有1枚胚胎(1號胚胎)在平衡易位相關的14號染色體斷點下游拷貝數為3；有3枚胚胎(8、9和10號胚胎)在平衡易位相關的14號染色體斷點下游拷貝數為1；另外，夫婦A的1-5號胚胎在10號染色體出現新發的拷貝數異常，拷貝數為3，夫婦B的4號胚胎在15號染色體出現新發的拷貝數異常，拷貝數為1(表1)。

表1 胚胎CNV分析結果

分析14號染色體拷貝數BAF分布發現，在拷貝數異常區域(黃色標記)，染色體拷貝數為3的胚胎(1-1、1-7和1號胚胎)的拷貝數異常區域BAF主要離散分布在0、0.33、0.66和1附近(圖2A)；染色體拷貝數為1的缺失胚胎(2-2、8、9和10號胚胎)的拷貝數異常區域BAF主要離散分布在0和1附近(圖2C)；分析14號染色體拷貝數LRR分布發現，染色體拷貝數為3的胚胎的拷貝數異常區域相較于拷貝數正常區域LRR升高，由于受基因組GC含量、基因組復雜度及芯片熒光信號的飽和度影響，LRR升高不太明顯(圖2B)；染色體拷貝數為1的胚胎的拷貝數異常區域相較于拷貝數正常區域LRR降低(圖2D)。

2.單體型連鎖分析(PGH)結果：分別以夫婦A的1-3號胚胎、夫婦B的2號胚胎為參考，在該斷點±3 Mb做PGH。夫婦A的PGH發現，1-1、1-7和2-2號胚胎從斷裂點位置P點(chr14：69 757 189)開始，父源鏈的點分布出現顏色交叉現象(胚胎中父源鏈顏色與參考胚胎父源鏈顏色相同表示來自同一條鏈，相反則表示來自不同鏈，提示存在同源重組的可能)，即為拷貝數異常區域；夫婦B的PGH發現，1、8、9和10號胚胎從斷裂點位置P點(chr14：70 880 373)開始，父源鏈的點分布出現顏色交叉(圖3)。綜合PGH結果，判斷14號染色體斷裂點在chr14：69 757 189上游。

3.基因型分析結果：基因型分析發現，chr14：69 757 189上游區域中距離其最近的符合孟德爾遺傳定律且基因型為雜合的位點位于chr14：69 340 569，表示斷點位于chr14：69 340 569下游；下游中距離chr14：69 340 569最近的不符合孟德爾遺傳定律的純合型位點位于chr14：69 752 603，表示斷點位于chr14：69 752 603上游(表2)。

結合CNV、PGH及基因型分析，我們最終可推測該平衡異位的14號染色體的斷點位置在chr14：69 340 569～69 752 603之間，范圍大小約412 Kb。

三、植入前遺傳學檢測(PGD)結果

PGH分析以男方母親(I2)為參考，則需要選擇攜帶者母親基因型為純合、兄弟二人基因型為雜合的位點分別構建單體型。兄弟二人中的易位攜帶鏈，則可根據鏈的顏色判斷胚胎的來源鏈。14號染色體斷點區域與16號染色體斷點區域的顏色均與參考鏈顏色相反時，即為正常型胚胎；與參考均相同即為易位攜帶型胚胎；一條顏色相同，另一條顏色相反時則為不平衡易位型胚胎。

夫婦A的1-3和1-6號胚胎在14q24.1斷裂點區域與16p13.33斷裂點區域顏色與參考鏈相反，均為正常型胚胎，可優先移植；1-5號胚胎在14q24.1斷裂點區域與16p13.33斷裂點區域顏色與參考鏈相同，為遺傳性易位攜帶型胚胎，同時1-5號胚胎在10號染色體存在新發CNV異常，故不可移植；1-1、1-7和2-2號胚胎在14q24.1斷裂點區域與16p13.33斷裂點區域，其中一條鏈顏色與參考鏈相反，另一條鏈顏色與參考鏈相同，則為不平衡易位攜帶型胚胎，故不可移植(圖4A、圖4B和表3)。同理，夫婦B中2、3、5和7號胚胎為正常型胚胎，可優先移植；1、8、9和10號胚胎為不平衡易位攜帶型胚胎，故不可移植；其中4號胚胎單體型雖為正常型，但其15號染色體存在新發CNV異常，故不可移植(圖4C、圖4D和表3)。

A：染色體拷貝數為“3”的胚胎的BAF分布；B：染色體拷貝數為“3”的胚胎的LRR分布；C：染色體拷貝數為“1”的胚胎的BAF分布；D：染色體拷貝數為“1”的胚胎的LRR分布；藍色為拷貝數正常區域；黃色為拷貝數異常區域圖2 胚胎14號染色體BAF和LRR分布圖

A：夫婦A；B：夫婦B；男方兩條鏈以紅色和藍色表示；女方兩條鏈以黃色和綠色表示圖3 PGH圖

表2 胚胎斷點區域SNP位點基因型分析結果

(續表)

A：夫婦A和各胚胎14號染色體；B：夫婦A和各胚胎16號染色體；C：夫婦B和各胚胎14號染色體；D：夫婦B和各胚胎16號染色體；男方兩條鏈以紅色、藍色表示，女方兩條鏈以黃色、綠色表示圖4 平衡易位相關染色體的PGH分析圖

表3 胚胎PGH分析結果

四、臨床妊娠結局

綜合胚胎形態學評估，夫婦A和夫婦B最終分別選擇胚胎等級均為4BB的1-3號和5號囊胚期胚胎單囊胚植入母體。分別在孕18周時進行羊水穿刺，產前診斷結果與胚胎檢測結果一致，胎兒并無染色體異常，均于2019年12月足月順利分娩正常嬰兒。

討 論

SNP芯片是通量較高、使用范圍較廣的分析染色體拷貝數的平臺，它能有效提高染色體拷貝數的檢測精度，在一定范圍內增加樣本數無需額外的費用，亦可反復使用從而提高異常染色體的檢出效率[15-17]。本研究中應用的胚胎植入前PGH技術就是一種基于SNP芯片的連鎖分析PGD技術，其原理是通過對胚胎與其父母、近親進行全基因組范圍內的SNP檢測，通過SNP位點進行家系 PGH，然后通過對染色體異常的胚胎進行斷裂點定位，從而確定該家系易位染色體的斷裂點區域，最后對該區域上下游連鎖區域進行分析，確定攜帶有易位染色體的單體型，進而確定胚胎是否攜帶了易位的染色單體。與其他用于區分平衡易位的方法不同，PGH技術無需預實驗、操作較簡單，不僅能檢測胚胎的拷貝數變異和易位攜帶，還能夠應用于大部分單基因遺傳病的檢測，而且其快速的報告周期特點更符合臨床需求[18-22]。

PGH檢測過程中連鎖分析的前提是該區域沒有發生同源重組，一般認為上下游5 Mb范圍內的同源重組概率較低，遺傳距離越近，發生同源重組的概率越低。對于平衡易位或羅氏易位患者，易位斷裂點通常為同源重組高發區域，而這些斷裂點附近的同源重組通常會給胚胎PGH帶來潛在的分析風險，所以斷裂點的位置的精確定位有助于保障分析結果的準確性。本研究基于芯片檢測技術，提出一種新的有助于精確平衡易位斷裂點的分析思路。芯片檢測技術一般基于芯片位點LRR和BAF的分布情況進行CNV檢測，但是這種簡單指標的分析方法通常分辨率不是很高。為了精確易位斷裂點，我們結合LRR、BAF、PGH和基因型分析等4個方面對平衡易位斷裂點進行精確定位。基于孟德爾遺傳定律，家系中正常的二倍體區域可以正常分型，而CNV區域的分型結果通常是錯誤的。基于這一原則，可根據家系中的分型結果協助精確斷裂點。胚胎的位點基因型同樣可以幫助確定染色體易位斷點范圍，比如缺失區域不會存在雜合性位點等。本文中平衡易位患者經CNV結合LRR與BAF指標分析，確定染色體平衡易位斷裂點在chr14：70 000 000(±3 Mb)。結合單體型分析結果，縮小斷點范圍至chr14：69 203 145～69 757 189(554 Kb)。在考慮斷點區域位點的基因型與孟德爾遺傳定律后，斷點范圍縮小至chr14：69 340 569～69 752 603(412 Kb)。斷點縮小的范圍與芯片中位點設計的密度、位點人群頻率、家系中有效位點的分布等相關。

本文中的平衡易位染色體為14號染色體長臂和16號染色體短臂末端，核型為46，XY，t(14；16)(q24；p13.3)。由于16號染色體末端拷貝數異常的區域較小，難以明確判斷CNV，所以本文只基于14號染色體做出判斷。但在各胚胎的PGH過程中，我們同樣針對各個胚胎16號染色體的相互之間分型結果與14號染色體是否一致進行了考慮。需要注意的一點是，夫婦B中的8號、9號和10號3個胚胎染色體結構一致，在斷裂點上游三者的分型結果即顏色應該相同。但是，從PGH圖中可以明顯看出斷裂點上游區域9號胚胎的顏色(紅色)跟其他兩者(藍色)不同，可以推測在9號胚胎距離斷裂點很小的區域可能發生了同源重組(圖4C)。由于9號胚胎存在CNV，所以很容易被排除在備選胚胎之外，但是如果該重組發生在沒有CNV的胚胎當中，則要相當警惕斷點的具體位置，因為很可能將單體型結果判斷成相反面。本文介紹了PGH用于輔助判斷CNV，但是如果拷貝數重復是父親或母親一方一條染色體的2個拷貝，這種情況也值得注意，因為通常這種拷貝數異常并不會導致位點的基因型發生變化，進而并不會帶來單體型分型異常。本文結合LRR、BAF、PGH和基因型4個方面的生物學信息，可有效定位CNV斷裂點。

本研究在常規PGH檢測的基礎上，結合了易位斷裂點精確定位分析，為臨床PGH技術的開展提供了新的思路，未來可以推廣到更多的臨床案例分析中，可以降低因斷裂點附近發生同源重組引起分型錯誤的概率，從而進一步提升PGH技術的準確性。