宮腔微生物與輔助生殖妊娠結局的相關性分析

張倩，王瑤，張寧，陳霞慧，趙夢思，于月新

(北部戰區總醫院生殖醫學中心，沈陽 110016)

近年來我國不孕癥人數呈現逐年遞增趨勢，其發病機制復雜且病因多樣化。輔助生殖技術 (ART) 已成為解決大部分不孕患者生育問題的治療方法，女性生殖道微生物與ART妊娠結局的關系也日益受到人們的關注。女性生殖道微生態系統是由多種微生物群組成的獨特的動態體系。長期以來，女性生殖道微生態主要集中在對陰道的研究。女性陰道中的微生物在陰道衛生、性生活頻率等方面的影響下，其構成也在發生著變化，菌群失調和致病微生物感染可能對生育及分娩產生影響[1-2]。有研究推測生殖道微生態的異常可能與不良妊娠結局，如植入失敗、自然流產及早產等有一定相關性[3-4]，但目前對生殖道微生態進行分析的研究還很少。

隨著實驗室檢測技術的進步，研究者開始對宮頸、宮腔、卵泡液等多方面進行微生態的檢測，推翻了子宮腔內是無菌的傳統理念，并證實宮腔內有微生物的存在，且宮腔內微生物的構成對生育力有一定的影響。本研究通過使用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF)，對接受ART助孕治療的女性患者宮腔菌群進行分析，并探討宮腔微生態改變與妊娠結局的關系。

材料與方法

一、研究對象

以2019年10～12月在我院生殖醫學中心行體外受精/卵胞漿內單精子注射(IVF/ICSI)治療并接受凍融胚胎移植(FET)的不孕患者為研究對象。

納入標準：(1)年齡<40歲；(2)移植胚胎中至少包括1枚形態學評分優質胚胎(7～9細胞I級D3胚胎或3BB以上的D5囊胚)；(3)無粘膜下肌瘤或內膜息肉等宮腔占位性病變者。排除標準：(1)移植困難者；(2)輸卵管積水沒有處理或處理后仍復發；(3)中重度子宮內膜異位癥；(4)抗磷脂綜合征等免疫性疾病、甲狀腺功能異常、嚴重系統性疾病；(5)薄型子宮內膜(子宮內膜厚度<5.0 mm)以及胚胎移植術前7 d內查陰道分泌物提示分泌物異常者。本研究共納入238個周期。本研究經我院倫理委員會審查批準，研究對象均簽署知情同意書(批件號：202H2019PJ005)。

二、研究方法

1.子宮內膜準備方案：根據月經周期是否規律主要分為自然周期和人工周期。(1)自然周期方案。對于月經周期規律、排卵正常患者，采用自然周期方案，在月經周期的第8～10天開始進行超聲評估，當優勢卵泡的直徑為16～20 mm時，抽取外周血檢測孕酮及促黃體生成素(LH)水平，如果沒有排卵，則取消周期。(2)人工周期方案。在月經周期第2～4天開始口服補佳樂(拜耳，德國)，初始用量為從第1～8天為4 mg/d，第9～12天調整為6 mg/d，并可根據內膜厚度調整補佳樂劑量，當子宮內膜厚度達到6.0 mm或更多且無優勢卵泡生長時，肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)40 mg/d，口服孕激素(黃體酮膠囊，浙江仙琚)200 mg/d進行內膜轉化并納入本研究。

2.樣本采集及菌群培養鑒定：按照規范[5]進行胚胎移植操作后，對胚胎移植導管的內管尖端進行細菌培養，以分離培養出可能存在的細菌。胚胎移植時注意避免移植導管內管與陰道壁及宮頸的接觸。在5% CO2、37℃有氧和厭氧環境下分別用巧克力瓊脂培養基(不含抗生素)(鄭州安圖生物工程股份有限公司)和血瓊脂培養基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)培養導管尖端的菌株，培養48～72 h。本研究培養微生物不包括衣原體和支原體。

3.菌落鑒定：采用MALDI-TOF(bruker microflex maldi-tof MS，布魯克，德國)及其相關配套軟件進行宮腔菌群培養的分析鑒定，標本制備、上機檢測及結果分析參照相關鑒定操作流程和標準化操作專家共識[6]。

4.妊娠結局判定：胚胎移植14 d之后，血HCG≥50 U/L為HCG陽性；HCG陽性者于移植后4周行超聲檢查，子宮腔內見孕囊和原始心管搏動為臨床妊娠。

5.觀察指標：記錄研究對象的一般資料、胚胎移植情況及臨床妊娠率，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/總周期數×100%。

6.分組：根據質譜鑒定結果并按宮腔內微生物是否以乳桿菌為主要菌群分成3組，即只含乳桿菌的為乳桿菌主導組(n=122)、未檢測出細菌的為檢測陰性組(n=40)和同時含乳桿菌與非乳桿菌為非乳桿菌組(n=76)。

三、統計學分析

結 果

一、菌群培養結果

質譜鑒定結果顯示，檢出細菌的移植周期占總移植周期的83.19%(198/238)，在菌屬水平上，宮腔內檢出的乳桿菌屬占檢出菌屬總體的57.34%，非乳桿菌屬包括鏈球菌屬、棒桿菌屬、葡萄球菌屬、加德納菌屬和腸球菌屬(表1)。

表1 宮腔菌群在菌屬水平的分布情況(%)

二、3組患者的一般資料比較

3組患者的年齡、配偶年齡、體重指數(BMI)、不孕年限、不孕類型、不孕因素、基礎FSH、子宮內膜厚度及FET內膜準備方案等比較均無顯著性差異(P>0.05)；乳桿菌主導組和非乳桿菌組中的抗苗勒氏管激素(AMH)均顯著低于檢測陰性組(P<0.05)，而乳桿菌主導組與非乳桿菌組比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、3組患者移植情況及妊娠率比較

3組患者的移植胚胎類型及移植胚胎數比較均無顯著性差異(P>0.05)；乳酸桿菌主導組患者的臨床妊娠率顯著高于非乳桿菌組(P<0.01)，而檢測陰性組與非乳桿菌組比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

四、宮腔內菌群與臨床妊娠結局的關系

單因素分析結果顯示，宮腔內菌群分布差異對臨床妊娠率有顯著影響(P<0.05)，而不孕年限、BMI和不孕類型等對妊娠結局均無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表2 三組患者的一般資料比較[(-±s)，n(%)]

表3 三組患者移植情況及妊娠比較n(%)

表4 臨床妊娠結局的單因素分析

采用多因素Logistic回歸分析宮腔內菌群對妊娠率的影響，顯示當宮腔內菌群為非乳桿菌時可以使臨床妊娠率顯著降低84%[OR=0.16，95%CI=(0.06，0.39)，P<0.05]，在調整女方年齡、基礎FSH、AMH和移植胚胎數等混雜因素后，宮內菌群仍是影響妊娠結局的獨立危險因素87%[OR=0.13，95%CI=(0.04，0.38)，P<0.01](表5)。

表5 調整相關參數后 Logistic回歸分析宮腔內菌群與妊娠率的關系

討 論

在人類微生物計劃 (human microbiome project，HMP) 的推動下，微生物群對人類生殖的重要性越來越被認可[7]。ART成功主要取決于患者年齡、胚胎質量和子宮內膜容受性。隨著實驗室技術的發展，獲得優質胚胎的幾率已經大幅度提升，子宮內膜容受性則成為提高輔助生殖結局的新突破口。女性生殖道微生物群可能會影響全身及局部的免疫[6]，從而影響到內膜容受性[9]。女性生殖道微生物已成為近些年的研究熱點。

早期由于對微生物鑒定及取樣方面的局限性，人們認為宮腔內是無微生物的。但隨著技術的發展，利用16s rRNA技術對子宮內膜檢測發現了低生物量微生物，從而證實子宮內確實是有菌的[9]。現在對于子宮微生物群的研究越來越多，但主要集中在子宮內的微生物群對后代和新生兒免疫的影響等方面，而子宮內膜菌群對妊娠結局以及對生殖健康的重要性往往被忽視[10]。本研究是使用MALDI-TOF MS進行菌屬鑒定，這是近年來在微生物鑒定領域應用發展迅速的一種新型鑒定技術。該技術與16s rRNA測序的方法相比，雖然16s rRNA測序技術可以檢測到需要特殊培養的稀有菌屬，但其卻不能區分活菌或者死菌的細菌碎片。而MALDI-TOF MS則能夠檢測蛋白質和核酸等生物大分子，鑒定的準確率優于傳統的方法，且操作簡單、耗時時間較短，整個過程幾乎不需要額外的耗材，鑒定花費低，可對臨床樣本快速診斷，更能滿足臨床的需求[11]。

目前，病原菌影響胚胎著床的機制尚不清楚。有研究表明微生物群對免疫有影響[12-13]。如果微生物在妊娠前已經影響了子宮的免疫環境，則會極大的影響子宮內膜的接受能力和初始胎盤的正常形成，從而可能會導致不孕或胎盤功能受損。也有學者認為以非乳桿菌為主的微生物群可能會引發子宮內膜炎，從而影響胚胎植入的成功率[14]。此外，人們還需考慮一些直接產生微生物的代謝物和(或酶)相關的作用機制，這些代謝物能夠產生相關的復合物，在子宮內膜上皮誘導關鍵的細胞通路。在胚胎著床期，需要子宮內膜與囊胚之間正確的相互作用，滋養細胞的遷移與血管重構的潛在機制可能與內膜有關，如果微生物及其代謝物在復雜的子宮環境中影響了任何一種生理作用，都可能影響胚胎著床。

Tao等[15]通過評估從70名行IVF-ET患者導管尖端獲得的微生物群，檢測到大量乳桿菌，其次還有棒桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等。Franasiak等[16]通過對33名接受輔助生殖助孕婦女在ART期間胚胎移植導管尖端獲得子宮內膜微生物組進行的研究，也證實了乳桿菌是最豐富的菌屬。本研究發現接受ART的不孕癥女性宮腔內菌群優勢菌屬主要為乳桿菌屬，與上述研究結果一致。在子宮內膜容受期宮腔內菌群的分布與妊娠結局相關性分析中發現。當移植時宮腔內微生態以非乳桿菌為主時妊娠率顯著降低(P<0.05)，調整模型中影響臨床妊娠率的相關因素后進行多因素Logistic分析發現，未調整和調整模型未顯著改變相關結果[OR=0.13，95%CI=(0.04，0.38)，P<0.01]，提示宮腔內菌群為非乳桿菌是影響輔助生殖結局的獨立危險因素。這與以往大部分的研究結果是一致的[17-22]。但也有研究者發現以乳桿菌為主的宮腔內環境并不能改善妊娠結局[23]。因此，兩者關聯性仍需探討。同時，我們也發現宮腔內檢測陰性組妊娠率高于非乳桿菌主導組(65.00% vs 36.84%)，Logistic分析發現，檢測陰性組與臨床妊娠之間有顯著的相關性(P<0.05)，提示即使未檢出乳桿菌的存在，妊娠也是有可能的，但次于以乳桿菌為主導組。

綜上所述，ART結局受諸多因素影響，宮腔內異常菌群的存在可能影響妊娠結局。其機制尚需深入研究，可為今后不孕癥的臨床決策提供依據和新思路。