動植物DNA主動去甲基化途徑及其調控機制研究進展

劉春雨,王 宇,解莉楠

(東北林業大學生命科學學院東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室,中國黑龍江哈爾濱150040)

DNA甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基供體,經DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化,在胞嘧啶的5位碳原子上添加1個甲基的過程,是一種很重要的表觀遺傳修飾。DNA甲基化調節基因的表達和沉默,與癌癥和老年癡呆等許多疾病密切相關,同時也調控很多關鍵的生物學過程,如抑制印記基因表達、使X染色體失活、控制基因組織特異性表達等[1]。

DNA甲基化分為從頭合成甲基化和維持甲基化。目前,人們已在哺乳動物中鑒定出3種DNA甲基轉移酶:DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1負責維持DNA甲基化,而DNMT3A和DNMT3B則負責DNA甲基化的從頭合成[2]。DNMT3L(DNMT3-like)雖然沒有甲基轉移酶的催化活性,但是可以調控DNMT3A和DNMT3B的表達[3～4]。動物中的DNA甲基化主要發生在CG位點,并且在整個基因組范圍內的CG位點都是高甲基化。植物中的DNA甲基化存在3種不同的類型,包括對稱的CG、CHG和非對稱的CHH(H代表堿基A、T或C)位點的甲基化,這些不同位點的甲基化的從頭合成都是由RNA介導的DNA甲基化 (RNA-di rected DNA methylation,RdDM)途徑來實現的[5]。通常,不同位點的甲基化需要不同的酶來維持。甲基轉移酶1(methyltransferase 1,MET1)是哺乳動物DNMT1的同源體,負責維持CG類型的甲基化[6]。CMT3(chromomethylase 3)是植物中特有的DNA甲基轉移酶,是維持CHG位點甲基化所必需的[7]。DRM2(domains rearranged methyltransferase 2)在維持CHH位點甲基化的作用中最為突出,因為CHH位點的甲基化主要依賴于DMR2參與的RdDM途徑,并且DMR2的活性受到Rd-DM途徑的調控[8～9]。動植物中的DNA甲基化不僅在發生位點上有所不同,而且在發生部位上也不盡相同。植物中的DNA甲基化主要發生在轉座子和其他重復的DNA序列；動物中的DNA甲基化則發生在基因的啟動子區,主要抑制下游基因的表達。

為了保證基因在適當的發育階段進行程序性表達,生物體內也會發生DNA去甲基化(demethylation)的現象。DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)被胞嘧啶取代的過程[10～11]。DNA去甲基化的過程要比甲基化的過程復雜得多。一般認為,DNA去甲基化有兩種方式:主動去甲基化(active demethylation)和被動去甲基化(passive demethylation)[10～11]。被動去甲基化發生在 DNA復制時期。DNA復制屬于半保留復制,新合成的DNA鏈是沒有任何修飾的。在正常情況下,一系列DNA甲基轉移酶參與DNA從頭修飾。當這類維持機制被抑制或失活時,每次復制都只會產生沒有發生甲基化修飾的DNA。這樣在多代復制后,生物體中的總體DNA甲基化水平就會逐漸降低。但通過這種“稀釋”的模式去除DNA甲基化的效率極低。所以,生物體需要通過其他的方式調節DNA甲基化程度,以應答體外環境的變化。因此,主動去甲基化的過程在生物體內至關重要。與DNA甲基化形成和維持機制相比,DNA去甲基化的機制還有待進一步得到闡釋,本文主要對動植物中DNA主動去甲基化途徑及其調控機制的最新研究進展進行綜述及比較分析,為后續相關研究提供理論支持。

1 植物DNA主動去甲基化

1.1 植物DNA主動去甲基化酶的發現及結構分析

多項研究表明,植物體內的DNA主動去甲基化過程主要是通過ROS1/DME(repressor of silencing 1/demeter)介導的堿基切除修復(base excision repair,BER)機制來實現的[12～13]。2002 年Gong 等[14]利用RD29A-LUC(RD29A-luciferase)系統篩選到ros1突變體,該突變體導致RD29A啟動子處的DNA甲基化過高,從而使其沉默；同時,體外實驗證實ROS1具有DNA糖基化酶的活性,這為后續的研究奠定了基礎。同年,Choi等[15]在擬南芥中研究胚胎和胚乳發育過程時篩選到了dme突變體,隨后Gehring等[16]通過進一步研究發現,在dme突變體的種子胚乳中CG甲基化水平有所升高,表明DME可能在DNA去甲基化的過程中起作用。另有研究報道,該家族蛋白中的另外兩個蛋白質DML2(demeter-like 2)和 DML3(demeter-like 3)也能夠識別所有類型的胞嘧啶甲基化并切除5mC[17]。相關的序列對比分析結果顯示,擬南芥ROS1/DME家族蛋白結構中都包含HhH-GPD(helix-hairpinhelix-Gly-Pro-Asp)結構域、FES(4Fe-4S)簇結構域、與組蛋白H1相似的H1結構域和未知功能的DUF結構域(圖1)。其中,FES結構域負責酶的激活,HhH-GPD結構域在ROS1/DME雙功能酶活性發揮中起著關鍵的作用[18]。

1.2 ROS1/DME介導的DNA主動去甲基化途徑

ROS1/DME介導的DNA主動去甲基化途徑是一種類似于DNA損傷修復中的堿基切除過程。當甲基化的DNA存在時,ROS1/DME會識別甲基化的胞嘧啶并且水解DNA鏈中的脫氧核苷酸和堿基之間的糖苷鍵,從而將其切除。當裂解DNA骨架時,ROS1和DME催化β消除反應或δ消除反應(圖 2)。β 消除反應會產生 3′-磷酸-α,β-不飽和醛(3′-phosphoric acid-α,β-unsaturated aldehyde,3′-PUA)間隙,而 δ消除反應則會產生 3′-磷酸末端間隙[13,19]。3′-磷酸和 3′-PUA 都會轉化為 3′-羥基(3′-OH),以便在DNA聚合酶和連接酶活性下可以填補間隙。許多蛋白質參與了DNA去甲基化的過程,如ZDP(zinc finger DNA 3′phosphoesterase)和 APE1L(apurinic/apyrimidinic endonuclease)。全基因組甲基化分析表明,zdp突變體中上百個內源基因位點高度甲基化,這可能是由于在突變體中去甲基化的過程受到了阻礙；隨后相關研究發現ZDP與ROS1具有相互作用[20～21]。APE1L與ROS1蛋白在體內共定位,ape1l突變體種子胚乳中甲基化水平增加,從而降低受去甲基化酶DME調控的印記基因FWA(flowering wageningen)和MEA(medea)的表達水平。此外,生化數據表明純化的ZDP蛋白可以將3′-磷酸基團轉化為3′-OH基團[20,22],而APE1L蛋白可以將3′-PUA末端加工為3′-OH末端[23],所以ZDP和APE1L產生3′-OH的過程作為兩個獨立的分支共同參與ROS1/DME介導的DNA去甲基化。甲基化的胞嘧啶被切除以后,未甲基化的胞嘧啶如何填補縫隙？這一問題至今還沒有確切的答案,目前在擬南芥中鑒定到了具有DNA連接酶活性的AtLIG1(Arabidopsis thaliana DNA ligase 1),它可以在DNA鏈的兩端連接上未甲基化的胞嘧啶,從而實現去除DNA甲基化的目的[24～25](圖 2)。

圖1 擬南芥ROS1/DME家族蛋白結構域[18]Fig.1 The domains of Arabidopsis ROS1/DME family proteins[18]

圖2 堿基切除修復介導的植物DNA主動去甲基化[21,23]Fig.2 Base excision repair-mediated DNA active demethylation in plants[21,23]

1.3 ROS1介導的DNA主動去甲基化的調控

ROS1介導的DNA主動去甲基化過程受許多因素的調控,比如:轉錄水平上受到的調控、酶活性水平上受到的Fe-S基序調節。此外,ROS1識別靶位點的過程還受到各種蛋白質復合物的影響。

1.3.1 ROS1轉錄水平的調節

ROS1基因的表達受許多因素調節。其可與RdDM途徑相互拮抗來預防特異位點上的DNA超甲基化,并且在所有已知的RdDM相關的突變體中ROS1的表達量均降低,說明DNA甲基化和主動去甲基化之間是相互協調的關系[26～30]。除Rd-DM相關的突變體外,met1突變體中ROS1的表達同樣被抑制[31]。ROS1啟動子上有一段可以調控甲基化水平的39 bp序列,被稱為DNA甲基化監測序列(methylation monitoring sequence,MEMS)[29]。RdDM途徑使全基因組的甲基化升高,MEMS上的高甲基化促進了ROS1的表達,防止甲基化過高,從而使機體甲基化保持平衡。MEMS的高甲基化發生在ROS1功能缺失的突變體中,說明MEMS也是ROS1的靶位點。相關研究報道,MEMS的超甲基化伴隨著ROS1的表達增加,并導致擬南芥的根系長度顯著增加[29,32]。在MEMS的上游包含一個螺旋狀的轉座子,該轉座子可能有助于吸引DNA甲基化因子,并使啟動子對DNA甲基化作出反應,但是通過DNA甲基化促進ROS1轉錄的特異性轉錄因子尚未發現[33]。綜上可知,MEMS可通過調控ROS1的表達來協調DNA甲基化與去甲基化之間的平衡,避免DNA甲基化的過低或過高,進而維持生物體良好的生長發育狀態。

1.3.2 ROS1酶活性水平的調節

ROS1功能的發揮不僅受轉錄水平的調控,還受酶活性水平的調節。很多研究都關注了ROS1/DME去甲基化酶的表觀遺傳學功能,但是人們對其酶活性調控機理仍知之甚少。早在30年前,相關研究就發現一種在堿基切除修復(BER)過程中起作用的DNA糖基化酶(DNA glycosylase)中含有Fe-S簇結構域,并且該結構域對其酶活性的保持至關重要[34]?，F有研究顯示,ROS1/DME去甲基化酶中也含有同樣保守的Fe-S功能域(如圖1中的FES),且該結構域是ROS1/DME活性所必需的,Fe-S基序突變的DME蛋白在體外不能切開甲基化的DNA[35～36]；同樣的體外實驗在ROS1中也得到了相同的結果[32]。以上信息表明,Fe-S基序對ROS1/DME蛋白酶活性的保持具有重要的作用。

1.3.3 ROS1靶位點識別水平的調節

除上述兩種調控外,ROS1識別DNA甲基化位點的過程也受到多種因子的調控。目前DNA主動去甲基化途徑的下游反應已經取得了突破性的進展,但是去甲基化酶識別甲基化胞嘧啶的具體過程仍然有待探索。當前研究已經篩選到了一系列參與DNA主動去甲基化位點識別的酶和相關因子,這些酶和因子相互作用,共同參與了ROS1識別甲基化DNA的過程[37～42]。該過程可以簡要概括為以下四步:第一步,蛋白乙?；?increased DNA methylation,IDM)復合體識別甲基化的胞嘧啶,并且在該位點對組蛋白進行乙?；揎棧坏诙?染色質重塑復合體SWR1識別組蛋白乙?；瘶擞?并被招募到染色質上；第三步,SWR1復合體在染色質上招募H2A.Z蛋白[43]。H2A.Z是組蛋白H2A的變體,主要位于常染色質區域,其在DNA高甲基化區域的水平較低,存儲H2A.Z的復合體發生突變會導致全基因組DNA甲基化水平的升高[44]；第四步,H2A.Z和ROS1直接相互作用,將ROS1招募到甲基化胞嘧啶上進行DNA主動去甲基化過程(圖3)。

2 動物DNA主動去甲基化

2.1 動物DNA主動去甲基化關鍵酶的發現及結構分析

過去的幾十年中,人們一直在動物中尋找像植物中ROS1/DME一樣可以直接去除DNA甲基化的酶,但始終沒有鑒定出ROS1/DME同源蛋白,這表明動物中直接切除甲基化胞嘧啶的化學反應可能并不存在。Kriaucionis等[45]發現哺乳動物細胞中的甲基化胞嘧啶可轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)。Song 等[46]研究發現5hmC在腦組織和多能胚胎干細胞中尤其豐富,并且這些5hmC存在于高CpG含量的啟動子上,這些啟動子的DNA甲基化水平通常較低。Williams等[47]經過一系列研究發現,在動物中一些關鍵分子間接作用于DNA去甲基化過程。這些酶首先修飾甲基化的胞嘧啶,隨后使其被DNA堿基修復途徑去除。2002年,Ono等[48]發現TET(ten-eleven translocation)蛋白可以使5mC轉化為5hmC；2009年,Rao等[49]發現TET1過表達細胞的基因組DNA在CG中含有修飾,推斷它可能在高等生物中介導5mC羥基化。進一步的研究顯示TET1確實能夠使哺乳動物DNA中的5mC轉化為5hmC,這為TET1在DNA去甲基化中的作用提供了證據[49]。

圖3 IDM、SWR1和H2A.Z在DNA主動去甲基中的工作模型[43]Fig.3 Working model for the roles of SWR1,IDM and H2A.Z in active DNA demethylation[43]

TET 蛋白是 Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)依賴型雙加氧酶。TET蛋白家族包含3個成員,分別是TET1、TET2和TET3,其中TET1在小鼠體細胞中以TET1s的形式存在,在胚胎干細胞和原始生殖細胞中以TET1e的形式存在[50]。TET3也有兩個亞型,分別為TET3s和TET3o,前者在神經元分化期間表達量較高,后者則在卵母細胞中大量表達[51～52]。TET家族所有成員(包含亞型)都含有雙鏈β螺旋(double stranded β helix,DSBH)和富含半胱氨酸(Cys-rich)結構域[53](圖4)。這些結構域在TET蛋白參與DNA主動去甲基化的過程中具有關鍵作用,其中DSBH結構域負責TET對5mC的氧化,Cys-rich結構域負責TET與DNA之間的結合。另外,TET1和TET3所特有的CXXC結構域負責TET蛋白在CpG島區域內的富集。CXXC結構域缺失的突變體中TET蛋白在CpG島的富集率有所降低,表明該結構域在TET蛋白靶向到特定的DNA位點過程中發揮了重要的作用[55]。

圖4 小鼠TET蛋白的結構域[54]Fig.4 The domain of the mouse TET protein[54]

2.2 TET介導的DNA主動去甲基化途徑

盡管動物不能像植物那樣直接將甲基化胞嘧啶切除,但是動物體內也有獨特的去除甲基化胞嘧啶的方式。目前,人們已提出幾種可在動物中介導DNA主動去甲基化的機制[56～58],其中TETTDG(thymine DNA glycosylase)途徑得到了最廣泛的支持[54]。在該途徑中5mC可以被TET蛋白逐步氧化成5hmC、5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和 5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine,5caC)[59～60],然后通過胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和堿基切除修復(BER)機制除去5fC和5caC,完成5mC的主動去甲基化(圖5)。

圖5 哺乳動物中TET介導的DNA主動去甲基化[58]Fig.5 TET-mediated DNA active demethylation in mammals[58]

在TET蛋白介導DNA主動去甲基化的過程中,5mC、5hmC和5fC都是其底物,但TET蛋白對這3種底物表現出不同的結合或催化活性。生化和結構研究表明,相對于5hmC和5fC,TET蛋白優先選擇5mC作為其反應的底物；酶動力學分析顯示,人TET1或TET2催化5mC至5hmC的轉化速率快于5hmC至5fC和5fC至5caC的轉化速率[61]。并且,無論互補鏈的狀態如何,CpG體系中TET蛋白參與5mC的氧化速率大致相似[45]。TET蛋白的這種底物偏好性在生物體內是十分重要的,因為DNA主動去甲基化的過程伴隨著許多DNA從頭合成甲基化和DNA復制的反應。

2.3 TET介導的DNA主動去甲基化的調控

TET介導的DNA主動去甲基化反應可以在各種水平被調節,5mC、5hmC和5fC被氧化的反應直接受到底物活性的影響,同時這些反應也可以通過輔助因子調節。與植物中ROS1一樣,TET可以在轉錄和翻譯水平進行調節。此外,將TET靶向到甲基化DNA區域的因子也可以調節其識別靶位點的過程,但是與植物中ROS1識別靶位點的過程有所不同。

2.3.1 TET蛋白氧化過程的調控

TET蛋白介導的氧化反應需要α-KG和氧氣作為底物,并以Fe(Ⅱ)為輔助因子。在該反應中,Fe(Ⅱ)首先與TET蛋白中保守的His-Asp殘基結合,并且與H2O和α-KG相互協調,然后α-KG被氧氣氧化生成CO2和琥珀酸酯,并產生高價的Fe(Ⅳ)中間體,該中間體與5mC反應生成5hmC和琥珀酸鹽[62]。當反應所需的底物和輔助因子發生變化時會導致氧化反應產生不同的結果。α-KG由異檸檬酸通過異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)氧化脫羧反應產生[63],IDH1或IDH2的過表達能夠促進細胞中5hmC的產生[64～65]。此外,idh突變體可通過產生2-羥基戊二酸(2 hydroxyglutarate,2HG)與α-KG競爭性結合來抑制TET蛋白活性,進而使5mC無法轉化為5hmC[64]。除α-KG外,氧氣對TET蛋白介導的氧化反應的影響已在體外量化[66],缺氧會降低5hmC的水平但不會使TET蛋白表達下調,并且該變化與細胞增殖和代謝物濃度的變化無關,這表明氧氣可直接參與調節TET蛋白介導的氧化反應[66]。作為反應的輔助因子,Fe(Ⅱ)也能夠影響TET蛋白的活性,細胞中鐵濃度的增加可提高5hmC的水平[67]；TET結構中與鐵結合的關鍵殘基的突變會降低其酶活性[66]。

2.3.2 TET轉錄水平的調控

除上述底物和輔助因子會影響氧化反應外,TET的功能在轉錄水平上也會受到調控。與植物中MEMS參與ROS1轉錄水平調節不同的是,TET和TDG的mRNA水平受到很多微RNA(microRNA,miRNA)調節[68]。其中,miR-15b、miR-22和miR-125等過表達會降低TET的表達并且降低 5hmC 的水平[68～70]；miR-26a 和 miR-29 過表達會抑制TDG的表達,而敲除這兩個miRNA則可增強TDG的表達,5hmC的水平與TDG的變化趨勢一致[71～72]。

2.3.3 TET翻譯后水平的調控

TET蛋白不僅在轉錄水平受到調控,而且在翻譯后修飾上也受到調控。翻譯后,TET蛋白酶活性可通過共價修飾和蛋白質之間的相互作用來調節[73]。研究顯示,TET蛋白保守的賴氨酸殘基泛素化能夠促進TET蛋白與染色質的結合,在人TET2蛋白的N端,兩個保守的賴氨酸殘基發生乙?；軌蛱岣咂涿富钚?增強其在氧化應激下對5mC的靶向性[74]。TET蛋白的水平也可以通過蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質水解來調節,TET2蛋白的分子伴侶IDAX(inhibition of the Dvl and Axin complex)過表達會導致TET2蛋白的降解,而將IDAX耗盡則會使TET2蛋白含量升高[75]。鈣蛋白酶在小鼠胚胎干細胞的維持和分化過程中介導TET蛋白水解[76],泛素蛋白酶則在人癌細胞介導TET2的降解,進而導致5hmC水平的降低[74]。

2.3.4 TET靶位點識別水平的調控

與ROS1類似,TET蛋白對基因組中甲基化DNA的識別也會受到調控。但是與植物中一系列酶和復合物參與ROS1識別靶位點的過程不同,動物中這一過程需要TET和TDG的結構特性、局部染色質環境以及外在因素相協調。為了有選擇性地在特定CpG位點去甲基化,TET和TDG需要被定位到相應的基因組區域。在小鼠胚胎干細胞中進行的染色質免疫沉淀測序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)分析顯示,TET1在CpG島和二價啟動子處富集,這種CpG結合偏好性是由于TET蛋白的CXXC結構域會優先選擇富含CpG區域[56],這表明CXXC結構域促進了TET1與CpG島的結合。對于沒有CXXC結構域的TET2蛋白,這種結合可能是由其相互作用蛋白質IDAX來介導[77]。TET2蛋白的分子伴侶也有助于將其招募到甲基化DNA位點上。研究報道,PRDM14(PR domain zinc finger protein 14)、PRC2(polycomb repressive complex 2)和LIN28A在小鼠胚胎干細胞中可以招募TET蛋白并與其相互作用[77～79]。在小鼠胚胎干細胞中,TDG與TET1具有類似的分布模式,并且在活性啟動子和增強子處富集,這種分布模式可能是由于TET與TDG之間存在相互作用[80]。此外,還有其他因素參與TET靶位點識別的過程,如生長停滯、DNA損傷誘導蛋白(GADD45A)和雌激素受體β等[81～82]。

3 總結

植物和動物通過相似的機制來調控DNA從頭合成甲基化和甲基化的維持,但其主動去甲基化的過程具有一定差異。動植物中的DNA主動去甲基化大致都需要經歷三步反應。在植物中,ROS1/DME首先將5mC切除,酶切產物經β消除反應或δ消除反應分別生成3′-PUA間隙和3′-磷酸間隙,隨后3′-PUA間隙和3′-磷酸間隙分別在APE1L和ZDP的催化下生成3′-OH基團,最后通過堿基切除修復機制完成5mC的去除(圖2)。在動物中,TET-TDG介導的DNA去甲基化途徑被廣泛認可,其主要過程如下:TET蛋白先將5mC氧化成5fC和5caC,隨后由TDG將它們切除,最后通過堿基切除修復機制獲得未修飾的胞嘧啶(圖5)。盡管動植物中DNA主動去甲基化過程的最后都是通過相同機制完成的,但是在反應初期植物是通過ROS1/DME直接將5mC切除,而動物則需要在TET的催化下逐步將5mC氧化為5hmC、5fC和5caC后再實行胞嘧啶的切除。雖然動物中目前仍然沒有找到類似于ROS1/DME可以直接切除甲基化胞嘧啶的糖基化酶,但是已經確定動物中的DNA去甲基化是由5mC的修飾開始,包括脫氨基作用、氧化作用、甲基團脫氫,而不是直接移除甲基基團。綜上所述,動物DNA主動去甲基化途徑比植物要更復雜。

有趣的是,研究者利用CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因編輯技術將不具有切割活性的dCas9(dead Cas9)與TET1催化結構域融合后轉化模式植物擬南芥,成功地實現了目標基因的靶向去甲基化,最終激活了FWA基因的表達,產生了延遲開花的表型,為TET蛋白能夠介導DNA去甲基化提供了佐證[83]。植物中沒有TET酶,這表明TET1介導的去甲基化機制較為保守,但在進化的過程中DNA主動去甲基化的途徑產生了分歧,植物通過ROS1切除而動物則通過TET的氧化作用最終去除5mC。

在調控方面,植物ROS1介導的去甲基化與RdDM途徑的甲基化之間有一個動態反饋抑制環,即RdDM途徑使MEMS上的高甲基化促進了ROS1的表達,而ROS1表達后又抑制全基因組的高甲基化,從而使植物基因組甲基化處于一個合理的水平。在動物中目前還沒有發現這種機制,TET的表達更多受miRNA調控。

此外,本文還總結了參與植物和動物DNA主動去甲基化過程的關鍵酶及調控該過程的關鍵因子,具體如表1和表2所示。

表1 參與動植物主動去甲基化的關鍵酶及其功能Table 1 Key enzymes involved in active demethylation of plants and animals and their functions

表2 動植物主動去甲基化過程的調節因子及其功能Table 2 Regulators and functions of active demethylation in animals and plants

4 展望

盡管現在DNA去甲基化途徑的研究已經取得了重大的突破,但是仍有許多環節尚不明確。對于植物DNA去甲基化而言,DNA去甲基化酶是如何精準地作用到靶位點上的？目前,除了在擬南芥中發現的IDM和SWR1復合體參與的調控機制外,是否還有其他的調控通路？另外,在其他作物中DNA去甲基化酶的精準調控機理尚未被發掘。本課題組利用CRISPR/Cas9技術對大豆的DME進行基因編輯,獲得了dme突變體,并發現突變體種子的全基因組甲基化水平升高,同時突變體種子的百粒重與野生型相比顯著增加(數據未發表),但是DME影響大豆種子發育的過程尚不明確,仍需進一步探究。表觀遺傳學與基因編輯技術的有機結合為改良農藝性狀、加速遺傳育種提供了新的手段。對于動物DNA去甲基化而言,也有一些問題需要解決。首先,TET蛋白的功能尚未在各種生物過程中得到很好的定義；其次,需要進一步研究以確定氧化的5mC,特別是5hmC,是否可以作為讀取蛋白質介導生物功能的識別位點；第三,某些基因組區域對TET介導的氧化反應具有抵抗力,機體選擇性保護這些區域免受氧化的機制還不完全了解；第四,TET蛋白介導的氧化反應在被動去甲基化過程中的確切作用仍有待確定；第五,大多數的研究都側重于TET而不是TDG,但由TDG介導的修復未經修飾的胞嘧啶這一過程也尤為關鍵；最后,盡管成熟神經元中5hmC的含量很高,但DNA主動去甲基化在哪里發生尚不清楚?？偟膩碇v,所有上述問題將會是完善動植物中DNA主動去甲基化機制的關鍵所在。