養(yǎng)陰化瘀解毒方促進(jìn)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

朱 靜,嚴(yán)小軍,劉紅寧,葉依殷,尚廣彬

(江西中醫(yī)藥大學(xué)江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心,中國江西南昌330004)

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率居第三位、死亡率居第二位的惡性腫瘤[1],手術(shù)、放療和化療是西醫(yī)臨床癌癥治療的三大常規(guī)療法,但術(shù)后高復(fù)發(fā)率和病灶易轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者生存時(shí)間過短和生存質(zhì)量不高[2～3]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,結(jié)腸癌是機(jī)體在正氣內(nèi)虛的基礎(chǔ)上,痰濁、瘀血等互結(jié)而形成的一種本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的疾病[4],古籍中多稱之為“腸風(fēng)”“臟毒”“腸蕈”等,中醫(yī)臨床根據(jù)病因病機(jī)處方遣藥,治療上多采用恢復(fù)人體正氣、養(yǎng)肝腎之陰、化瘀解毒、清利腸道之法。養(yǎng)陰化瘀解毒方(Yangyin Huayu Jiedu Decoction,YYHYJDD)是全國名中醫(yī)張小萍教授臨床使用的驗(yàn)方,其在預(yù)防和治療結(jié)腸炎方面取得了一定的療效[5]。基礎(chǔ)研究證明YYHYJDD可促進(jìn)病變細(xì)胞凋亡,從而逆轉(zhuǎn)小鼠結(jié)腸癌癌前病變和上皮內(nèi)瘤變,但具體機(jī)制尚不清楚[6]。本實(shí)驗(yàn)初步探究了YYHYJDD含藥血清對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響,以期為臨床治療結(jié)腸癌提供理論和實(shí)踐支持。

1 材料與方法

1.1 藥物制備

YYHYJDD所需藥材[6]:炒白芍20 g、敗醬草20 g、茯苓 15 g、黨參 20 g、黃芩 10 g、黃連 6 g、當(dāng)歸 10 g、炒白術(shù) 10 g、防風(fēng) 6 g、木香 6 g、大黃 6 g、三七6 g、肉桂3 g、炙甘草6 g,購自江西省中醫(yī)院(批號(hào):2017101102),均由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室鑒定,符合《中華人民共和國藥典》2015年版。取藥后先用清水500 mL浸泡藥物30 min,武火煎沸后改文火煎,保留藥渣,提取藥液,再加水300 mL煎煮,取2次藥液混合,濃縮YYHYJDD生藥2.88 g/mL,用標(biāo)示好的消毒棕色玻璃瓶保存于4℃冰箱備用。

含藥血清制備:無特定病原(specific pathogenfree,SPF)雄性 SD大鼠 70只,體重(180±20)g,隨機(jī)分為空白血清組40只,YYHYJDD組30只。YYHYJDD給藥組相當(dāng)于60 kg成人144 g/d的等效劑量,按人體表面積折算即14.4 g/kg進(jìn)行藥物灌胃,空白血清對(duì)照組給予同等量的生理鹽水,每天稱重調(diào)整灌胃劑量,連續(xù)給藥7 d,隨后禁食1夜,不禁水。配置10%的水合氯醛,按動(dòng)物體重4 mL/kg進(jìn)行腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血,全血在4℃冰箱靜置2 h后3 000 r/min離心15 min,取上清,56℃熱滅活過濾,最后置于-20℃冷凍備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠購于長沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(湘)2016-0002,在江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心動(dòng)物房飼養(yǎng):常溫25℃左右；濕度控制在60%左右；每天定時(shí)換水、換墊料；兩天換框1次,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后灌胃。

1.3 試劑和儀器

CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(簡(jiǎn)稱MTS,美國Promega公司,貨號(hào):G3580)；AOEB雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):CA1140)；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):AP01)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司,貨號(hào):SH30809)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,貨號(hào):GP3108)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS,北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,貨號(hào):BF-0011)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,貨號(hào):1101-18611)；accutase酶(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):AT001)；BCA總蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,貨號(hào):BCA02)；一抗anti-Bcl-2(美國Abcam公司,貨號(hào):ab32124)；一抗anti-Bax(美國Abcam公司,貨號(hào):ab32503)；二抗goat anti-rabbit IgG(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號(hào):CW103S)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma 3111,美國Thermo Fisher公司)；多功能酶標(biāo)儀(Spark 10M,瑞士Tecan公司)；流式細(xì)胞儀(Moflo XDP,美國Beckman Coulter公司)；倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)(IX71,日本Olympus公司)；大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-220SE,瑞士步琪公司)；水平電泳儀(Powerpac,美國Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Chemi Doc XRS+,美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。常規(guī)復(fù)蘇HCT116細(xì)胞后將其培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并傳代,待HCT116細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5組。正常組:結(jié)腸癌細(xì)胞中加入20%PBS和80%胎牛血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中均含有10%的胎牛血清)；空白血清對(duì)照組:結(jié)腸癌細(xì)胞中加入20%空白血清(大鼠給予生理鹽水灌胃取血獲得)和80%胎牛血清培養(yǎng)基；YYHYJDD含藥血清組:低、中、高劑量組的結(jié)腸癌細(xì)胞中分別加入5%、10%、20%的含藥血清,同時(shí)分別加入比例為15%、10%和0%的空白血清,胎牛血清培養(yǎng)基的量均為80%。

1.4.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)平行孔,置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和 96 h后加入MTS溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,隨后取出培養(yǎng)板并在多功能酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔OD值。細(xì)胞抑制率=(空白血清對(duì)照組平均OD值-給藥組平均OD值)/空白血清對(duì)照組平均OD值。

1.4.4 細(xì)胞AOEB染色及形態(tài)觀察

平鋪在6孔板中的細(xì)胞用含藥血清處理72 h后易脫落,為了避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,依據(jù)1.4.3細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果,我們統(tǒng)一選擇含藥血清干預(yù)48 h的細(xì)胞開展AOEB染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁之后進(jìn)行分組處理,5組細(xì)胞中每個(gè)孔的液體量均為200 μL,每組3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞48 h后,棄掉上清液,用PBS清洗,輕柔倒去漂浮的細(xì)胞和PBS,每孔再加入PBS 100 μL和1︰1比例配制的AOEB染液3 μL,避光染色5 min,用PBS洗1遍棄掉熒光染液,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照記錄。

1.4.5 細(xì)胞Annexin V-FITC/PI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

各組細(xì)胞均按5×105個(gè)/孔接種3個(gè)復(fù)孔,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,隨后取出。用accutase酶消化細(xì)胞,1 000 r/min離心3 min,PBS清洗3次,棄掉上清,加入預(yù)冷的1×binding buffer重懸,再加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)5 μL 和碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL,避光染色15 min。細(xì)胞過濾后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Flow jo 7.6.1軟件分析。在Annexin V-FITC/PI結(jié)果中,左下象限為活細(xì)胞群；右下象限為早期凋亡細(xì)胞；右上象限為晚期凋亡細(xì)胞；左上象限為壞死細(xì)胞和機(jī)械損傷細(xì)胞。

1.4.6 免疫印跡分析

各組細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行總蛋白質(zhì)提取。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)的吸光度值,繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,將每組總蛋白質(zhì)吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算每組總蛋白質(zhì)濃度。配制蛋白質(zhì)樣品并在沸水中煮5 min進(jìn)行樣品變性,隨后進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中,上樣量為25 μg,電泳參數(shù)為80 V、120 min。電泳結(jié)束后在270 mA條件下轉(zhuǎn)膜50 min,洗膜3次,5%脫脂牛奶封閉50 min；在4℃冰箱搖床上一抗(anti-Bax、anti-Bcl-2的稀釋比例均為1︰1 000)孵育過夜,洗膜液洗膜3次后常溫孵育二抗(稀釋比例均為1︰5 000)1 h,再次洗膜3次后ECL顯影,用Image Lab軟件分析蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的灰度值。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YYHYJDD含藥血清抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞活性

為了探究YYHYJDD含藥血清對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響,在HCT116細(xì)胞中加入低、中、高劑量的含藥血清干預(yù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h,測(cè)定各組細(xì)胞在490 nm處的OD值。從表1結(jié)果可知,與空白血清對(duì)照組比較,含藥血清處理24 h對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響(P＞0.05),但處理48 h、72 h和96 h時(shí)細(xì)胞增殖明顯出現(xiàn)抑制,其中48 h和72 h 的效果顯著(P＜0.01)。

2.2 YYHYJDD含藥血清影響結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的形態(tài)

在熒光顯微鏡下,我們觀察到4種細(xì)胞形態(tài):1)活細(xì)胞,呈現(xiàn)正常的梭形,核染色質(zhì)為綠色均勻狀；2)早期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)出現(xiàn)綠色的固縮狀,熒光變深變亮,梭形細(xì)胞變圓；3)晚期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)出現(xiàn)橘色的固縮狀；4)壞死細(xì)胞,核染色質(zhì)出現(xiàn)橘色,細(xì)胞膨大變形。從圖1結(jié)果可知,正常組和空白血清對(duì)照組中的細(xì)胞絕大多數(shù)為著色均勻并呈綠色的活細(xì)胞；對(duì)于YYHYJDD含藥血清組而言,低劑量組的壞死細(xì)胞開始增多,中劑量組的早期凋亡細(xì)胞增多,高劑量組的壞死細(xì)胞最多。

2.3 YYHYJDD含藥血清對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

從圖2的Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果可知,與空白血清對(duì)照組相比,YYHYJDD含藥血清低、中、高劑量組均有促細(xì)胞凋亡的作用(P＜0.05或P＜0.01),且中劑量組效果最顯著,總凋亡率為10.22%～22.60%(P＜0.01),說明YYHYJDD含藥血清能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表1 YYHYJDD含藥血清對(duì)HCT116細(xì)胞活性的影響Table 1 Effects of YYHYJDD-containing serum on the activity of HCT116 cells

圖1 YYHYJDD含藥血清對(duì)HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響A:正常活細(xì)胞；B:早期凋亡細(xì)胞；C:晚期凋亡細(xì)胞；D:壞死細(xì)胞。標(biāo)尺:20 μm。Fig.1 Effects of YYHYJDD-containing serum on morphology of HCT116 cellsA:Normal living cells；B:Early apoptotic cells；C:Late apoptotic cells；D:Necrotic cells.Scale bar:20 μm.

2.4 YYHYJDD含藥血清對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

各組細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果如圖3所示。與空白血清對(duì)照組比較,Bax的表達(dá)在5%低劑量含藥血清組中無顯著差異(P＞0.05),但在10%、20%的含藥血清組中明顯升高(P＜0.01)；Bcl-2在20%的高劑量含藥血清組中的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)；Bcl-2/Bax 的比值在 10%(P＜0.05)、20%(P＜0.01)含藥血清組中下調(diào)顯著,說明YYHYJDD含藥血清能促進(jìn)HCT116細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá),同時(shí)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。

圖2 YYHYJDD含藥血清對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of YYHYJDD containing serum on apoptosis of HCT116 cells

圖3 YYHYJDD含藥血清對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig.3 Effects of YYHYJDD-containing serum on expressions of apoptosis-related proteins in HCT116 cells

3 討論

惡性程度高、發(fā)展速度快、預(yù)后差及放化療耐藥性的出現(xiàn)往往導(dǎo)致結(jié)腸癌的治療效果不明顯[7]。中醫(yī)藥以其獨(dú)特的理論和療效在防治結(jié)腸癌過程中發(fā)揮著積極的作用[8]。前期的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,YYHYJDD可以抑制病變細(xì)胞核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)小鼠結(jié)腸癌癌前病變腺窩區(qū)和上皮內(nèi)瘤變[9]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,YYHYJDD含藥血清促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡(圖1,圖2),這可能是其臨床治療結(jié)腸癌有效的重要原因。

免疫印跡結(jié)果顯示,YYHYJDD使結(jié)腸癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào),Bax蛋白的表達(dá)上調(diào),同時(shí)Bcl-2與Bax的比值下調(diào)(圖3),這可能是其促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。Bcl-2可維持線粒體膜的穩(wěn)定性和通透性,減少細(xì)胞色素C的釋放,并發(fā)揮抗凋亡的作用[10]。而Bax是Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白和凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)的同源物,在腫瘤的發(fā)展中表達(dá)異常,其能與Bcl-2形成異二聚體,從而抵消Bcl-2的作用,Bcl-2/Bax的比值決定了細(xì)胞的凋亡程度[11]。通過Bcl-2與Bax這條途徑,多種中藥具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用,比如:中藥重樓單體PP-22可促進(jìn)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡[12]；紅花多糖可提高結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡率[13]。另外,雷公藤甲素[14]和莪術(shù)醇[15]也可以通過下調(diào)Bcl-2蛋白、上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡。這都與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。雖然Bcl-2與Bax在腫瘤細(xì)胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用,但其蛋白質(zhì)表達(dá)程度并非是腫瘤細(xì)胞凋亡的唯一因素,因此YYHYJDD對(duì)Bcl-2與Bax翻譯后修飾的影響,以及它們與caspase家族、死亡受體和配體等的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。