姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌Nrf2通路相關蛋白質表達及細胞凋亡的影響

牛衍龍,曹建民,王 禎,周海濤,龔 平,胡 戈,田旭宸,邵芙蓉

(1.贛南醫學院康復學院,中國江西贛州341000；2.北京體育大學運動人體科學學院,中國北京100084；3.北京聯合大學生物化學工程學院,中國北京100023；4.北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,中國北京100191；5.長治醫學院,中國山西長治046000)

競技體育運動中,教練員和運動員為追求“更高、更快、更強”,常采用超負荷訓練以期提高運動和競技能力。受運動強度、恢復時間等多重因素影響,這一訓練方式在實際應用中常因運用不當,引發過度訓練綜合癥。課題組前期研究顯示,過度訓練可導致機體氧化應激水平提高,骨骼肌發生氧化應激損傷[1～2],心臟[3]、腎臟[4]細胞凋亡增加,相關組織結構改變及功能損傷。核因子E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作為機體抵抗氧化應激的關鍵轉錄因子,受到Kelch樣環氧氯丙烷(ECH)相關蛋白-1(Kelchlike ECH-associated protein 1,Keap1)的調節,在機體發生氧化應激時,易位至細胞核,作用于抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE),誘導下游多種抗氧化蛋白的轉錄,提高機體抗氧化能力。Nrf2還可通過調節抗凋亡因子Bcl-2的水平,防止細胞凋亡[5]。諸多研究發現,姜黃素(curcumin)作為天然二酮類化合物可有效緩解運動引起的氧化應激,改善骨骼肌損傷[6～7]。本實驗在前期研究基礎上,通過觀察大鼠骨骼肌組織形態,檢測骨骼肌氧化應激水平、細胞凋亡水平以及骨骼肌損傷標志物、Nrf2通路相關蛋白質及凋亡因子的表達,探究姜黃素緩解過度訓練所致骨骼肌細胞凋亡及結構/功能損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究所選用7周齡SPF (specific pathogen free)級 Wistar大鼠(體重:218.4 g±10.7 g)由北京大學醫學部實驗動物科學部提供,動物生產合格證編號:SCXK(京)2016-0010。實驗動物在北京體育大學SPF級動物實驗室進行飼養、訓練,環境條件如下:溫度(22±2)℃,相對濕度55%～75%,晝夜交替各12 h。

1.1.2 主要儀器

7020全自動生化分析儀(HITACHI公司,日本)；Wellscan MK3 酶標儀(Thermo Labsystems公司,美國)；Pannoramic MIDI全自動數字切片掃描系統(3D HISTECH公司,匈牙利)；Nikon 50i光學顯微鏡(Nikon公司,日本)；Allegra 25R臺式高速離心機(Beckman Coulter公司,美國)；NR-B17CC超低溫冰箱(Panasonnic公司,日本)；ISO9001電子天秤(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DK-2000-ⅢL型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.1.3 主要試劑

姜黃素(純度＞99%,陜西源泰生物科技有限公司)；羧甲基纖維素鈉(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；睪酮(testosterone,T)和皮質酮的(corticosterone,Cor)放射免疫試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的酶聯免疫試劑盒(北京華英生物技術研究所)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)；Nrf2、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、Bcl-2和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)的抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

75只Wistar大鼠預適應喂養4 d,隨后施加3 d適應性游泳訓練(運動量20 min/d),剔除不能完成游泳訓練的大鼠3只。在充分考慮過度訓練可能致死的情況下,將余下72只大鼠隨機分為安靜組(C)12只、姜黃素組(CC)12只、過度訓練模型組(OM)24只及姜黃素干預組(COM)24只。

1.2.2 訓練方案

C及CC組不進行任何運動干預,OM及COM組大鼠參照課題組前期設計方案(圖1)[4]進行8周遞增負荷游泳訓練。訓練中,若大鼠沉入水中10 s無法上浮,則將其托離水面休息5～10 min,隨后繼續訓練,完成當日方案。

1.2.3 營養干預方案

姜黃素用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成懸濁液,4℃存儲。CC組與COM組在每天第一次訓練開始前1 h灌胃1次,劑量為200 mg/(kg·d),體積為5 mL/kg；C組與OM組每天灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.2.4 樣品制備及檢測

8周實驗結束后,OM組及COM組由于部分大鼠死亡,分別剩余11只、14只。末次訓練結束24 h后使用乙醚麻醉大鼠,頸動脈取血致死。分離并切取0.5 cm×0.5 cm×1 cm體積的比目魚肌投入4%多聚甲醛中固定,剩余肌肉以錫紙包裹放入-80℃冰箱待用。血液樣本4℃靜置24 h后,于4℃ 3 000 r/min離心10 min,留取血清。骨骼肌SOD活性及MDA含量的檢測參照酶聯免疫試劑盒實施；Nrf2、HO-1、Bcl-2和Bax等蛋白質的表達水平采用免疫組化法檢測[8]；血清T、Cor的檢測采用放射免疫法,主要操作參照放射免疫試劑盒的說明書；血清CK和LDH采用全自動生化分析儀測定。

圖1 大鼠游泳訓練方案[4]游泳訓練負荷的表示方式為:訓練時間(min)*負荷(體重百分比)*訓練頻次(次)。Fig.1 Training program[4]The training load is shown as:time(min)*load(percentage of body weight)*frequency(times).

1.2.5 HE染色

組織固定24 h后取出,流水清洗24 h,乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋。切取4 μm厚度的石蠟切片置于載玻片上,60℃烘烤后HE染色,400倍光學顯微鏡下觀察骨骼肌的組織形態。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

將石蠟切片進行充分的脫蠟和水化,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS,pH=7.4)清洗后滴加蛋白酶K溶液,37℃孵育15 min。再次以PBS(pH=7.4)清洗,使用牛血清封閉,隨后滴加TUNEL反應液,37℃孵育60 min。加入3%的過氧化氫溶液封阻,室溫孵育10 min。加入適量converter-POD,37℃孵育30 min。清洗后DAB顯色,常規脫水后使用中性樹膠封片,顯微鏡下觀察、選片。

1.2.7 H-score評分

組織切片經全視野數字掃描,識別各強度陽性和陰性面積(單位:像素)以及陽性百分比,代入公式計算H-score[9]。細胞核陽性由強至弱依次為深棕色、棕黃色、淺黃色,藍色為陰性。H-score=(淺黃色細胞密度×1)+(棕黃色細胞密度×2)+(深棕色細胞密度×3)。骨骼肌組織中Nrf2、HO-1、Bcl-2和Bax的表達結果及細胞凋亡水平均以H-score形式表示。

1.2.8 數據處理

2 結果

2.1 運動及營養干預對大鼠血液指標的影響

血清T/Cor比值是評價運動負荷狀況及診斷過度訓練的金標準[10]。血液中CK、LDH等骨骼肌細胞滲出物的活性可以有效反映骨骼肌損傷程度[11]。為評測過度訓練動物模型是否成功建立、運動及營養干預對大鼠骨骼肌損傷相關標志物的影響,本實驗分離并檢測了大鼠血清中T和Cor的含量,以及CK和LDH的活性。結果顯示:CC組血清T和Cor及T/Cor比值與C組無顯著性差異；OM組T及T/Cor比值顯著低于C組(P＜0.01),同時Cor含量、CK及LDH活性顯著高于C組(P＜0.01)；COM組血清T及T/Cor比值顯著高于OM組(P＜0.01),而Cor含量、CK及LDH活性顯著低于OM組(P＜0.01)。具體數據見表1。

2.2 運動及營養干預對大鼠骨骼肌組織形態的影響

為評價運動及營養干預對大鼠骨骼肌組織形態的影響,本實驗對大鼠骨骼肌進行了HE染色及顯微觀察。光鏡觀察結果顯示:C與CC組大鼠的骨骼肌形態正常,細胞核未見腫脹、固縮現象；OM組骨骼肌肌纖維間細胞增生,有大量炎性細胞浸潤,血管周圍膠原增生嚴重；COM組大鼠的骨骼肌損傷程度輕于OM組,僅輕度的肌纖維間細胞增生和炎性細胞浸潤(圖2)。

2.3 運動及營養干預對大鼠骨骼肌氧化應激水平的影響

為觀察運動及營養干預對大鼠骨骼肌氧化應激水平的影響,本實驗采用酶聯免疫吸附法檢測了骨骼肌的SOD活性和MDA含量。結果顯示:CC組的SOD和MDA指標與C組相比無顯著性差異；OM組的SOD活性顯著低于C組(P＜0.01),而MDA含量顯著高于C組(P＜0.01)；COM組的SOD活性顯著高于OM組(P＜0.01),而MDA含量顯著低于OM組(P＜0.01)。具體數據見表2。

表1 運動及營養干預對大鼠血液指標的影響Table 1 Effects of exercise and nutrition intervention on blood parameters in rats

2.4 運動及營養干預對大鼠骨骼肌細胞凋亡水平的影響

為觀察運動及營養干預對大鼠骨骼肌細胞凋亡水平的影響,本實驗采用TUNEL法及免疫組化法檢測了骨骼肌細胞的凋亡水平及相關蛋白質Bcl-2和Bax的表達,結果顯示:CC組骨骼肌凋亡水平、Bcl-2和Bax的表達水平及兩者比值與C組相比無顯著性差異；OM組骨骼肌凋亡水平及Bax表達水平均顯著高于C組(P＜0.01),而Bcl-2的表達水平(P＜0.05)及 Bcl-2/Bax 比值(P＜0.01)顯著低于C組；COM組骨骼肌凋亡水平(P＜0.01)及Bax表達水平(P＜0.05)均顯著低于OM組,而Bcl-2/Bax比值顯著高于OM組(P＜0.05)；另外,Bcl-2的表達水平在COM組與OM組之間無顯著變化(P＞0.05)。具體數據見圖3、圖4和表3。

圖2 大鼠骨骼肌的組織形態(HE,400×)C:安靜組；CC:姜黃素組；OM:過度訓練模型組；COM:姜黃素干預組(下同)。大鼠末次訓練結束24 h后,取比目魚肌進行HE染色和組織病理學診斷。圖片為各組大鼠中具有代表性的比目魚肌顯微照片,標尺為20 μm。紅色箭頭:肌纖維間細胞增生；藍色箭頭:炎性細胞浸潤。Fig.2 Skeletal muscle tissue morphology of rats(HE,400×)C:Control group；CC:Curcumin group；OM:Overtraining model group；COM:Curcumin treatment combined with overtraining group(the same below).Histopathological examination of soleus was performed using HE staining 24 h after the last training of rats.Representative microphotographs were taken from the soleus of C,CC,OM and COM groups.Scale bar:20 μm；Red arrow:Myofibroblasts hyperplasia；Blue arrow:Inflammatory cell infiltration.

表2 運動及營養干預對大鼠骨骼肌中SOD、MDA的影響Table 2 Effects of exercise and nutrition intervention on levels of SOD and MDA in skeletal muscle of rats

2.5 運動及營養干預對大鼠Nrf2通路相關蛋白質表達的影響

Nrf2是機體內發揮抗氧化作用的關鍵分子,本實驗使用免疫組化法檢測了骨骼肌中Nrf2及其下游HO-1蛋白的表達,結果顯示OM組的Nrf2、HO-1水平顯著低于C組(P＜0.05)；COM 組的Nrf2、HO-1水平顯著高于OM組(P＜0.05),具體數據見圖5及表4。

3 討論

本研究通過對大鼠施加8周遞增負荷游泳訓練,建立了過度訓練動物模型,并通過檢測血清睪酮(T)與皮質酮(Cor)比值來反映運動負荷。實驗結果顯示,OM組大鼠的血清T/Cor比值顯著低于C組,下降幅度高達85.05%,符合過度訓練診斷標準(血清T/Cor比值下降40%)[12],提示造模成功。

圖3 各組大鼠的骨骼肌細胞凋亡水平采用TUNEL法檢測比目魚肌細胞凋亡水平。顯微鏡下視野細胞核陽性由強至弱依次為深棕色、棕黃色、淺黃色,藍色為陰性。放大倍數是400倍,標尺是20 μm。Fig.3 Apoptosis of skeletal muscle cells in each group of ratsThe apoptosis levels of soleus cells were detected by TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling).Under the microscope,the positive nuclei of apoptotic cells(from strong to weak)were dark brown,brownish yellow and light yellow,respectively,and the negative ones were stained blue.The magnification is 400× and the scale bar is 20 μm.

表3 運動及營養干預對大鼠骨骼肌凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響Table 3 Effects of exercise and nutrition intervention on apoptosis and expressions of Bcl-2 and Bax in skeletal muscle of rats

表4 運動及營養干預對大鼠骨骼肌Nrf2、HO-1表達的影響Table 4 Effects of exercise and nutrition intervention on expressions of Nrf2 and HO-1 in skeletal muscle of rats

圖4 大鼠骨骼肌中Bcl-2和Bax的表達采用免疫組織化學(石蠟切片)法檢測Bcl-2和Bax的表達。(A)各組大鼠中代表性的Bcl-2蛋白表達結果；(B)各組大鼠中代表性的Bax蛋白表達結果。蛋白質表達分析以切片陽性細胞數和染色強度為依據。顯微鏡下視野細胞核陽性由強至弱依次為深棕色、棕黃色、淺黃色,藍色為陰性。放大倍數是400倍,標尺是20 μm。Fig.4 The expressions of Bcl-2 and Bax in skeletal muscle of ratsImmunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of Bcl-2 and Bax.(A)A representative expression result of Bcl-2 in each group；(B)A representative expression result of Bax in each group.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope,the positive nuclei of apoptotic cells(from strong to weak)were dark brown,brownish yellow and light yellow,respectively,and the negative ones were stained blue.The magnification is 400× and the scale bar is 20 μm.

圖5 大鼠骨骼肌中Nrf2和HO-1的表達采用免疫組織化學(石蠟切片)法檢測Nrf2和HO-1的表達。(A)各組大鼠中代表性的Nrf2蛋白表達結果；(B)各組大鼠中代表性的HO-1蛋白表達結果。蛋白質表達分析以切片陽性細胞數和染色強度為依據。顯微鏡下視野細胞核陽性由強至弱依次為深棕色、棕黃色、淺黃色,藍色為陰性。放大倍數是400倍。Fig.5 The expressions of Nrf2 and HO-1 in skeletal muscle of ratsImmunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of Nrf2 and HO-1.(A)A representative expression result of Nrf2 in each group；(B)A representative expression result of HO-1 in each group.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope,the positive nuclei of apoptotic cells(from strong to weak)were dark brown,brownish yellow and light yellow,respectively,and the negative ones were stained blue.The magnification is 400×.

CK和LDH是骨骼肌損傷的標志酶[11,13],MDA與SOD則分別反映脂質過氧化程度及自由基清除能力。在本研究中,與C組大鼠相比,OM組大鼠的骨骼肌組織形態發生明顯病理性改變,炎性細胞浸潤明顯增多,且血清CK、LDH活性顯著升高,骨骼肌MDA含量顯著增加,SOD活性顯著降低,提示OM組大鼠的氧化應激加劇,機體抗氧化能力受損；當給訓練大鼠同時補充姜黃素時,與單純訓練組相比,大鼠骨骼肌的病理學改變得到改善,同時血清CK、LDH活性顯著降低,骨骼肌MDA含量降低,SOD活性增加,說明姜黃素可在一定程度上減輕過度訓練所致的氧化應激及骨骼肌損傷。Nrf2是抗氧化過程的調節因子,在機體氧化應激水平較低時與Keap1結合,使自身活性受到抑制；而當氧化應激加劇時,Nrf2與Keap1分離并轉移至細胞核,隨后通過與ARE結合,誘導諸多抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶的轉錄,發揮其拮抗氧化應激的職責[14]。HO-1位于Nrf2下游,同樣參與機體抗氧化過程。研究表明,急性運動可激活骨骼肌Nrf2信號通路,提高機體抗氧化能力以應對氧化應激[15]；但長時間大強度運動會引起體內活性氧過量積累,骨骼肌Nrf2蛋白水平降低,導致骨骼肌結構/功能受損[16]。本研究結果顯示:就Nrf2與HO-1的水平而言,OM組較C組顯著降低,提示過度訓練抑制了骨骼肌Nrf2信號通路相關蛋白質的表達；而COM組較OM組顯著升高,說明訓練期間姜黃素的干預可促進骨骼肌Nrf2信號及其調控的抗氧化蛋白活性升高。Bcl-2和Bax是具有代表性的抗/促凋亡蛋白,二者比值變化在一定程度上可反映細胞凋亡的發生趨勢[17]。Tsai等[18]研究表明,Bcl-2受到Nrf2的調節,在Nrf2基因敲減心肌細胞中Bcl-2水平降低,高血糖誘導的細胞凋亡加劇。本研究發現,與C組相比,OM組的骨骼肌凋亡水平及促凋亡蛋白Bax水平均顯著升高,同時抗凋亡蛋白Bcl-2的水平顯著降低；與OM組相比,COM組中抗凋亡蛋白Bcl-2的水平顯著升高,同時骨骼肌凋亡水平及促凋亡蛋白Bax水平顯著降低。上述實驗結果有力地說明過度訓練使得機體氧化應激加劇,活性氧過量積累,Nrf2信號通路相關蛋白質表達下調,進而引發骨骼肌細胞凋亡,這可能是骨骼肌組織形態/功能受損的原因之一,而訓練期間補充姜黃素可以緩解過度訓練所致骨骼肌細胞凋亡及結構/功能損傷,其機制可能是:姜黃素通過激活過度訓練大鼠骨骼肌Nrf2通路,上調相關蛋白質的表達,提高骨骼肌中抗氧化酶的活性,減輕氧化應激水平。另外,Peng等[19]的研究顯示,C57BL/6小鼠通過7 d的200 mg/(kg·d)姜黃素口服干預,肝中Nrf2 mRNA水平顯著升高,但Nrf2蛋白的表達水平未發生顯著變化,同時HO-1、SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性以及MDA和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量也未發生顯著變化,這與本文的研究結果一致。在本研究中,CC組大鼠在靜息狀態下補充姜黃素后,Nrf2和HO-1的表達水平以及Nrf2下游抗氧化酶SOD的活性與C組相比均未發生顯著變化,這進一步證實姜黃素對正常狀態下骨骼肌中Nrf2及其下游抗氧化蛋白質的表達/活性的影響有限。

綜上所述,過度訓練可抑制骨骼肌Nrf2信號通路相關蛋白質的表達,使機體氧化應激水平升高,抗氧化能力下降,細胞凋亡加劇,組織形態發生病理性改變,即肌纖維結構受損,炎性細胞浸潤增多；而補充姜黃素可激活Nrf2通路及相關蛋白質的表達,提高抗氧化酶活性,減輕氧化應激水平,緩解骨骼肌凋亡及結構/功能損傷。