銅綠假單胞菌中Ⅵ型分泌系統及其參與鐵離子轉運機制的研究進展

王瑞營,張 娟,王 碧,侯亞文,吳斌艷,扈會整

(陜西省核工業二一五醫院檢驗科,中國陜西咸陽712000)

細菌進化出多種結構與周圍環境進行交流,分泌系統就是其中之一。利用分泌系統,細菌可以獲得營養、向外部環境分泌毒力因子以及直接靶向真核細胞使其致病。到目前為止,人們已在細菌中發現9套分泌系統(T1SS～T9SS)[1～2],2006年由Pukatzki等[3]研究小組命名的Ⅵ型分泌系統(typeⅥsecretion system,T6SS)是近幾年來研究較多的一種分泌系統。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)包含進化上完全不同的3種基因簇 H1-T6SS、H2-T6SS、H3-T6SS,這使銅綠假單胞菌成為研究T6SS的理想模式生物[4～5]。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌,是一種常見的人類機會致病菌,在人群中可以引起嚴重的急性和慢性感染[6]。銅綠假單胞菌的易感人群主要有燒傷、經器官移植術、呼吸道感染等免疫力低下患者,尤其在囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)患者中,該菌感染是主要的致死原因[7]。銅綠假單胞菌的特定生活方式使其對抗生素的抗性增加,給臨床治療帶來很大困難。我院收集的數據顯示,2016年9月至2019年8月銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗生素的比率明顯升高(表1)。T6SS在銅綠假單胞菌的致病過程中扮演了重要的角色,它通過復雜的類似噬菌體尾部結構的分泌裝置分泌效應蛋白并將其直接注入宿主細胞內[8],引起宿主細胞相應的病理性變化。鑒于T6SS在銅綠假單胞菌中的重要性,目前越來越多的科研人員致力于其致病性的研究,同時針對該系統的小分子抑制劑及疫苗的研發也為控制和預防銅綠假單胞菌的感染提供了新的治療手段。本文結合最近幾年銅綠假單胞菌中T6SS的最新研究成果及我們課題組的研究工作,闡述了T6SS的結構、調控及其參與鐵離子的轉運機制。

1 T6SS的結構、裝配及分泌

1.1 T6SS的結構

研究指出,在所有測序的革蘭氏陰性菌中,將近25%的細菌具有編碼T6SS的基因簇,其中就包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、不動桿菌屬(Acinetobacter)等[9]。T6SS的基因簇在不同物種間的組成成分略有差異,但其13個保守基因的編碼產物(TssA～TssM)是T6SS發揮正常功能所必需的,因此不同病原菌的T6SS在電子顯微鏡下具有相似的結構,它是一種復雜的收縮注射系統[10～13]。根據功能的不同,銅綠假單胞菌中T6SS的結構蛋白大致可以分為三類。第一類是與跨膜結構相關的蛋白質,包括TssL、TssM及脂蛋白TssJ等,這些蛋白質相互作用形成橫跨整個細胞膜的復合體；第二類是與類噬菌體尾部結構相關的蛋白質,它們根據功能的不同又可以分為3組:1)噬菌體注射器樣結構相關的蛋白質。該組蛋白質由溶血素共調節蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp)和纈氨酸-甘氨酸重復蛋白(valine glycine repeat protein G,VgrG)組成,其中Hcp形成尾管結構(類似T4噬菌體尾管蛋白質gp19[14]),VgrG形成細胞穿刺的尖端(與T4噬菌體尾部尖端蛋白質類似)。此外,Hcp-VgrG結構的末端還有一個類似針頭的脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重復蛋白(proline-alanine-alanine-arginine,PAAR),使注射器樣的結構更加穩定、尖銳[15]；2)噬菌體尾鞘樣結構相關的蛋白質。該組蛋白質由TssB/TssC亞基組成,亞基與噬菌體蛋白質gp18高度相似,其在Hcp管的周圍形成管鞘,通過管鞘的收縮將“注射器樣結構”射至靶細胞表面,從而穿刺靶細胞的細胞膜,將效應蛋白注入胞內[16]；3)噬菌體基板樣結構相關的蛋白質。該組蛋白質主要包括 TssA、TssE、TssF、TssG 和 TssK 等,形成與噬菌體gp25類似的基板樣結構[17]；第三類是裝置中負責能量供應的蛋白質,主要是ClpV(caseinolytic protease V)。ClpV是一種具有腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase,ATPase)活性的保守成分,對Hcp、VgrG及其同源蛋白底物的分泌至關重要[18]。T6SS的結構模型[19]詳見圖1。

表1 2016—2019年我院銅綠假單胞菌的耐藥率Table 1 The drug resistance rates of P.aeruginosa in our hospital from 2016 to 2019

1.2 T6SS的裝配及分泌

T6SS是一種特殊的大分子蛋白質輸出裝置,目前一些研究認為T6SS中噬菌體樣的注射裝置可能是在一些外界因子(如競爭性菌、鐵離子濃度、營養物質等)的刺激下被激活的,這樣注射裝置是如何裝配的就顯得尤為重要[20]。有研究認為,T6SS注射裝置被激活時,首先,TssM、TssL和TssJ形成跨膜結構,為接下來基板復合體的組裝提供平臺；其次,TssA、TssE、TssF、TssG 和 TssK 形成基座部分,VgrG、PAAR及效應蛋白被招募到基座復合物上,從而穩定整個復合物；隨后,Hcp蛋白以VgrG三聚體為聚合起點形成跨膜的尾管結構；最后,TssB-TssC隨著Hcp管的延伸而聚合到其外圍,從而完成整個裝配過程[19]。整個過程主要由ClpV水解ATP提供能量。相關研究報道,銅綠假單胞菌中T6SS的分泌具有與噬菌體注射遺傳物質類似的方式[9]。利用ClpV水解ATP釋放的能量,噬菌體樣尾鞘結構收縮,引起Hcp管向細胞外延伸,使VgrG-PAAR“針頭”樣結構刺穿靶細胞[21],此時效應蛋白通過與Hcp、VgrG或PAAR特異性結合而被輸送到靶細胞內[22]。當一輪分泌過程完成后,ClpV蛋白將部分尾鞘和Hcp管解聚,剩余未被注射的Hcp管狀物和基座復合物則在下一輪注射過程中被持續利用[19,23]。

圖1 T6SS的結構和機理示意圖(改編自參考文獻[19])TssJLM形成跨膜結構；TssAEFGK形成基座；Hcp形成尾管結構；TssBC在Hcp管周圍形成管鞘；VgrG-PAAR形成穿刺尖端；ClpV水解ATP為整個分泌裝置供能。Fig.1 Schematic representation of the structure and mechanism of the T6SS(adapted from reference[19])TssJLM forms a transmembrane structure,TssAEFGK forms a base,Hcp forms a tail tube structure,TssBC forms a sheath around Hcp,VgrG-PAAR forms a puncture tip,and ClpV hydrolyzes ATP to power for the entire secretion system.

2 銅綠假單胞菌T6SS的調控

在銅綠假單胞菌中T6SS受到很多因素的調控,包括群體感應系統(quorum sensing system,QSS)、鐵吸收調節蛋白(ferric uptake regulator,Fur)、RsmA(regulator of secondary metabolites A)等。

2.1 QS系統對T6SS的調控

銅綠假單胞菌在轉錄水平上的表達受到QS系統的調節。銅綠假單胞菌QS系統至少包括4種子系統:外源信號?；呓z氨酸內酯(acylhomoserine lactone,AHL)依賴的las系統和rhl系統；烷基喹諾酮[2-alkyl-4(1H)-quinolone,AHQ]信號依賴的pqs系統；非核糖體肽合成酶基因簇amb－BCDE 編碼的 iqs系統[11,24～25]。QS 系統的 las系統、rhl系統和pqs系統共同參與調控銅綠假單胞菌毒力因子的釋放、生活方式的適應性改變等。已有研究表明QS系統能夠調控銅綠假單胞菌中T6SS相關基因的表達,但對3種不同T6SS基因簇的調控存在一定的差異。Lesic等[26]研究發現,H1-T6SS的基因表達受pqs系統轉錄調節因子MvfR(multiple virulence factor regulator)和las系統轉錄調節因子LasR(transcriptional regulator)的負調控；而H2-T6SS和H3-T6SS的基因表達受到LasR和MvfR的正向調控。此外,部分H3-T6SS的表達需要MvfR調節子的關鍵成分PqsE(Pseudomonas quinolone signal E)參與,而H2-T6SS的表達不需要 PqsE[27～28]。

2.2 Fur對T6SS的調控

鐵作為必需的微量營養素,對細菌的生長是必不可少的[29],但當胞內的鐵過量時,Fe2+在過氧化氫存在的條件下產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞細胞的基本成分,而細菌可通過Fur調控菌體內鐵離子代謝的平衡,因此Fur對細菌生長和防止鐵毒性起重要作用[30]。除了在調節鐵穩態中的作用外,Fur還參與細菌許多毒力基因的表達。銅綠假單胞菌H2-T6SS啟動子區域存在兩個Fur基因盒,當外界環境中有鐵存在時,Fur阻止RNA聚合酶與-10區結合,從而抑制H2-T6SS相關基因的轉錄；當鐵受限制時,H2-T6SS基因受Fur的調控并表達,最終增強其對靶細胞的致病性[31]。

2.3 RsmA對T6SS的調控

雙組分系統(two-component system,TCS)信號傳導途徑是細菌和古細菌中的主要信號傳導機制,它們利用TCS途徑來監測關鍵的外部和內部刺激(包括營養物水平、離子和氣體濃度、溫度、氧化還原狀態和細胞密度等),并將這些信號轉化為適應性反應。T6SS分泌系統的分泌及相關毒力基因的表達由一對通過GacSA-RsmY/Z-RsmA級聯通路作用的雙組分傳感器激酶RetS(regulator of exopolysaccharide and typeⅢ secretion)和 LadS(lost adherence sensor)協同調節[32],RsmA作為此通路中的關鍵調控因子對銅綠假單胞菌的T6SS分泌及生物膜的形成具有負向調控作用,并與銅綠假單胞菌急性感染和慢性感染持續性相關的多種毒力表型密切相關[33～34]。在這一調控過程中,LadS引起通路的關鍵調控因子——游離的RsmA濃度降低,RetS則發揮截然相反的調控作用。因此,RetS和LadS能夠分別通過GacSA-RsmY/Z對RsmA進行間接調控,進而影響銅綠假單胞菌T6SS的分泌。

3 T6SS參與鐵離子的轉運

鐵作為酶、調節蛋白和參與新陳代謝信號傳導的蛋白質復合物的組分,在許多細菌的生命活動中發揮重要作用。金屬離子可以通過被動擴散穿過細胞膜,但是革蘭氏陰性菌必須通過主動運輸系統將稀有的金屬離子轉運至細胞內,以滿足細胞的需求[35～36],T6SS在其中就扮演了重要的角色。當受到外界刺激時,細菌通過T6SS分泌效應蛋白到細胞外,協助胞外的金屬離子通過細胞外膜蛋白進入周質,再進一步通過內膜的轉運蛋白運至胞內[27,37～38]。

Shen等[27]在缺鐵培養基中篩選生長缺陷的銅綠假單胞菌突變株時發現,H3-T6SS附近的PA2374(Pseudomonas aeruginosa 2374)基因(也稱作tseF)與已知的鐵獲取系統[39～41]具有協同作用。然而TseF作為T6SS的底物,研究中并沒有檢測到其與鐵離子之間的相互作用。那么,銅綠假單胞菌是否分泌了其他分子來參與鐵離子的吸收？該研究團隊通過蛋白質體外結合實驗(pull down實驗)發現,谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)-TseF蛋白可以與銅綠假單胞菌培養上清液中的某些分子相互作用,而且液相色譜-質譜(LC-MS)分析顯示該分子為PQS(Pseudomonas quinolone signal)；敲除產生PQS信號相關的基因pqsA和pqsH后,突變體的上清液與GSTTseF蛋白不再有相互作用,證明PQS與TseF確實有相互作用；在進一步的生長實驗中,tseF的缺失使Fe3+結合的PQS(PQS-Fe3+)不能提供銅綠假單胞菌生長所需的鐵,而Fe3+的加入使PQS與TseF有更強的相互作用,說明tseF促進銅綠假單胞菌從PQS-Fe3+中吸收鐵。銅綠假單胞菌的外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)含有大量PQS分子[42],研究顯示,從△tseF純化出的OMV蛋白中存在TseF,但△tseF△pqsH不表達TseF,這表明TseF與OMV的關聯是以PQS依賴的方式發生的[27]。這些結果表明,分泌的TseF被嵌入OMV中,再與鐵結合的PQS相互作用,將金屬離子轉運至細胞表面的受體上。

鐵離子是如何通過復合體進入細胞的？銅綠假單胞菌表面是否存在受體蛋白可以傳遞鐵離子？相關研究采用pull down實驗、質譜分析確定TseF與鐵載體(Fe3+-pyochelin)受體同源性的FptA[43]和毒力有關的孔蛋白OprF均有相互作用[27]。為了驗證TseF的結合靶點,Shen等[27]創建了突變體菌株PA△3Fe△tseF△fptA△oprF,然而該突變體只有當TseF和其中一個受體蛋白同時表達時,才能利用PQS-Fe3+作為唯一的鐵源促進生長。

綜上所述可知,TseF作為T6SS的底物,通過與PQS-Fe3+作用直接結合OMV,隨后與受體蛋白FptA和孔蛋白OprF相互作用,促進Fe3+向細胞內輸送[27]。圖2簡單整理了銅綠假單胞菌中T6SS參與鐵離子轉運的機制。

目前,銅綠假單胞菌中關于T6SS參與其他金屬離子轉運的研究還沒有被報道,但是已有研究發現在其他細菌中也存在類似的轉運機制。在假結核耶爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)中,人們發現存在與鐵載體類似的螯合化合物來轉運Zn2+,這一發現揭示了T6SS通過競爭基本物質和減少ROS來增強細菌適應性方面的功能[37]；在伯克霍爾德菌(Burkholderia thailandensis)中,Shen等[37]提出了由TonB依賴性外膜轉運蛋白MnoT和T6SS效應子TseM介導的Mn2+跨外膜主動轉運模型,并發現T6SS對伯克霍爾德菌在氧化應激條件下的生存具有重要意義[38],這為我們進一步研究銅綠假單胞菌提供了參考。我們課題組前期利用蛋白質質譜技術對H2-T6SS的分泌組進行了分析,結果顯示H2-T6SS分泌103種蛋白質,其中包括Cu2+結合蛋白Azu。為了探究H2-T6SS與Cu2+之間的轉運機制,我們通過實驗發現了H2-T6SS和Azu的轉錄調節子CueR,并揭示了在CueR的調控下H2-T6SS通過分泌效應因子Azu參與對Cu2+的吸收。那么Azu是如何將Cu2+轉運至胞內的呢？銅綠假單胞菌的外膜上也存在多種轉運蛋白,其是否也跟伯克霍爾德菌一樣,存在一種TonB依賴性外膜轉運蛋白,將Cu2+轉運至胞內？相關問題還需要進一步研究。

圖2 銅綠假單胞菌中T6SS參與鐵離子轉運的示意圖(改編自參考文獻[27])TseF通過T6SS分泌至胞外,與含有PQS-Fe3+的OMV結合,隨后細胞表面受體FptA或OprF對TseF進行識別,進而促進鐵向細胞內轉運。Fig.2 Schematic representation of T6SS involved in iron ion transport in P.aeruginosa(adapted from reference[27])TseF is exported by T6SS and binds to OMV containing PQS-Fe3+.Recognition of TseF by the cell surface receptor FptA or O-prF would facilitate the transport of iron into the cell.

4 小結與討論

銅綠假單胞菌是一種能引起多部位急慢性感染且難以用抗生素控制的機會致病菌,擁有多種致病機制和耐藥機制。大量研究表明,銅綠假單胞菌通過T6SS將毒力因子精準輸送至宿主細胞是其致病的關鍵[16～17,19]。本文重點闡述了T6SS的結構組成、調控及其參與鐵離子轉運的機制,總結了T6SS特殊的“注射器”結構不但可以分泌效應蛋白直接殺死競爭細胞,還可以通過轉運金屬離子競爭必需營養物質[18,22,44],揭示了T6SS在銅綠假單胞菌致病力中的重要作用。

近幾年,銅綠假單胞菌的T6SS已成為微生物學領域的研究熱點,其結構和生物學功能研究已經取得了很大進展,但是仍然有許多亟待解決的問題。例如:銅綠假單胞菌中T6SS識別靶細胞的分子機制是什么？T6SS是否可以通過效應物轉運其他的金屬離子或分子？新的一項研究表明,在銅綠假單胞菌中,T6SS的效應物TplE通過與其同源免疫蛋白TplEi相互作用而防止自身中毒,當在體外使用一種小分子化合物或肽作為TplETplEi的抑制劑時,可誘導銅綠假單胞菌中毒和自溶[45],該發現為新型抗生素的研發提供了新方法。基于此,我們可以試想在T6SS通過效應物轉運金屬離子的過程中是否也存在類似的作用方式。研究者可以從T6SS效應蛋白的結構入手,結合其活性位點,尋找與金屬離子之間的關系,探尋其中隱藏的機制。另外,隨著研究的不斷深入,銅綠假單胞菌T6SS參與其他金屬離子轉運方面的研究也將取得突破性的進展,例如:其如何通過轉運Cu2+、Mn2+等來適應進化過程中的復雜環境。這能為我們理解T6SS的不同功能及金屬離子對銅綠假單胞菌的作用提供新的思路。