小分子化合物WK429抑制炎癥和降低體液免疫反應的研究

胡 盼,邢雅婧,彭世鴻,謝玖清,郭偉凱,謝佳伊,劉明耀,易正芳

(華東師范大學生命科學學院上海市調控生物學重點實驗室生命醫學研究所,中國上海200241)

在周圍淋巴器官(如脾臟、扁桃體、淋巴結)中,成熟的B細胞在經過T細胞依賴性抗原刺激后,可依附于濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cell,FDC)組成網狀組織,形成一個短暫的動態組織結構,稱為生發中心(germinal center,GC)[1～2]。成熟的GC含有多種類型的免疫細胞,包括濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cell,Tfh cell)、生發中心 B細胞(germinal center B cell,GC B cell)、濾泡樹突狀細胞和巨噬細胞等[3]。

GC反應是一種T細胞依賴性抗原的免疫應答過程,這個過程包括活化的B細胞經歷克隆增殖、體細胞高頻突變、抗體類別轉換以及分化為產生高親和力抗體的漿細胞或記憶B細胞[4]。GC反應是體液免疫的基礎,是機體發揮獲得性免疫的重要組成部分。B細胞淋巴瘤6(B cell lymphoma 6,BCL6)是GC 形成和維持的重要調節因子[5～6]。在不同的免疫細胞類型中,BCL6具有其獨特的功能。BCL6對于Tfh細胞和GC B細胞的發育與功能至關重要[5]。BCL6已成為Tfh細胞的主要轉錄因子之一,影響Tfh細胞的分化及其特征分子的表達[7～8]。在抗體類別轉換過程中,BCL6允許GC B細胞進行體細胞高頻突變和DNA雙鏈的斷裂,并通過抑制DNA損傷反應和檢查點基因來更好地應對這種壓力[9]。

BCL6是一種轉錄抑制因子,屬于BTB/POZ/鋅指核酶家族成員,由706個氨基酸殘基組成。根據結構和功能,BCL6包括3個結構域:N端的BTB/POZ結構域(1～130號氨基酸殘基)、預測具有很少或沒有固定結構的中心區域(131～517號氨基酸殘基)和C端的6個鋅指結構域(518～681號氨基酸殘基)[9]。BCL6功能的發揮需要BTB二聚化形成同源二聚體,二聚化的BTB招募轉錄共抑制子SMRT(silencing mediator of retinoid and thyroid receptors)、N-CoR(nuclear receptor corepressor)和BCoR(BCL6 interacting corepressor),抑制靶基因的表達[9～11]。研究表明,在小鼠中敲除BCL6,小鼠不能形成GC,也不能產生高親和力抗體,而且BCL6基因全身性敲除小鼠會出現致死性炎癥疾病[6,12～13]。后續研究表明,在小鼠體內突變BTB結構域的兩個氨基酸(N21K,H116A)可以破壞其招募轉錄共抑制子的功能,使BCL6不能發揮轉錄抑制作用,同時小鼠體內的GC和分泌的高親和力抗體明顯減少,但是小鼠沒有出現炎癥和不良反應[14]。現有研究報道,GC和自身抗體存在于多種自身免疫性疾病患者體內或者動物模型中,比如:系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)[15～17]。目前,系統性紅斑狼瘡的靶向藥物極其缺乏,50多年來,美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)僅批準了貝利單抗(belimumab)用于系統性紅斑狼瘡的治療[18]。由于BCL6和GC的形成與高親力抗體的產生密切相關,已有研究者初步嘗試將靶向BCL6BTB結構域的多肽類抑制劑BPI-1用于治療系統性紅斑狼瘡。雖然只是個例治療,但是患者出現了積極的應答反應[19],這提示靶向BCL6BTB結構域的藥物具有治療系統性紅斑狼瘡的潛力。因此,本文以BCL6為靶點,開發針對BCL6BTB結構域的新型高效小分子抑制劑,系統性地評價BCL6小分子抑制劑對Tfh細胞、GC B細胞和漿細胞的影響,以及炎癥因子的分泌和抗體的生成,希望為體液免疫反應過強的自身免疫性疾病的預防或治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡雄性C57BL/6小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠腹腔巨噬細胞Raw264.7和人彌漫大B細胞株SUDHL4購于美國ATCC。分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)所用的血液來自志愿者的靜脈血,由上海長海醫院提供,符合人體倫理標準。小分子化合物來源于華東師范大學生命科學學院陳益華教授課題組。

均相時間分辨熒光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)稀釋緩沖液、6His-XL665 和GST-Tb購于Cisbio公司(美國)；BCL6蛋白和SMRT多肽購于北京安必奇生物科技有限公司；DMEM培養基、1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青霉素&鏈霉素(penicillin & streptomycin,P/S)雙抗均購自Gibco公司(美國)；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CFSE)、FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒、donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488、eFluor 660-anti-GL7 和IgG(total)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于ThermoFisher Scientific公司(美國)；4-羥基-3-硝基苯基乙酰基(4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl,NP)購自 Santa Cruz公司(美國)；雞免疫球蛋白(chicken gamma globulin,CGG)購于Cedarlane公司(加拿大)；白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白細胞介素-21(interleukin-21,IL-21)購于PeproTech公司(美國)；anti-CD16/32 Fc購于 eBioscience公司(美國)；白細胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)、γ 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和 IL-6 ELISA 試劑盒以及PerCP/cy5.5-anti-B220、PerCP/cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CXCR5、streptavidin-Cy3、PE-anti-IgG1和APC-anti-PD-1購于BioLegend公司(美國)；FITC-anti-FAS、FITC rat anti-mouse CD38、APC rat anti-mouse CD138、IgD、purified NA/LE hamster anti-mouse CD28、purified NA/LE hamster anti-mouse CD3e、紅細胞裂解液和 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)顯色液購于BD Pharmingen公司(美國)；冰凍切片包埋劑(opti-mum cutting temperature compound,OCT)購于Sakura公司(美國)；脂多糖、防淬滅劑、刀豆蛋白A和花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)購于Sigma公司(德國)；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,MTS)]購于Promega公司(美國)；造血細胞無血清X-VIVO培養基購于Lonza公司(瑞士)；羧甲基纖維素鈉購于上海阿拉丁試劑有限公司；淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。

1.2 小分子化合物的篩選

HTRF是一種可以用于檢測純液相體系中兩種蛋白質相互作用的技術,其結合了熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)和時間分辨熒光(time-resolved fluorescence,TRF)兩種技術,具有更高的靈敏度和穩定性。在本研究的篩選體系中,能量供體為GST-Tb和BCL6BTBGST,受體為6His-SMRT和6His-XL665,當BCL6BTB與SMRT結合時,BCL6BTB供體上的熒光能量會轉移到 SMRT受體上,此時在665 nm處能檢測到熒光,如果藥物破壞了二者的結合,則熒光消失或減弱。實驗體系為20 μL,在384孔板中加入5× BCL6BTB-GST(6.25 nmol/L)和 5× 6His-SMRT(200 nmol/L),體積均為4 μL,室溫孵育0.5 h,每組設兩個復孔,然后加入10×不同濃度WK429小分子化合物(2 μL),再加入GST-Tb和6His-XL665,體積均為5 μL,室溫孵育過夜,在Cytation 5細胞成像微孔板檢測儀上讀出每孔的數值。

1.3 細胞增殖實驗

1.3.1 外周血單個核細胞的分離

在50 mL離心管中加入15 mL淋巴細胞分離液,將血液輕輕吹打混勻,緩慢加入2倍體積的血液于淋巴細胞分離液面上,保持界面清晰。800 r/min離心25 min后,液面分為三層,棄去上層,吸取中間層至新的50 mL離心管中,加入1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH=7.4),輕輕吹打均勻,500 r/min離心10 min后棄上清,1×PBS重懸細胞并計數。

1.3.2 細胞的培養

人彌漫大B細胞株SUDHL4培養于含10%胎牛血清的1640培養基中,小鼠巨噬細胞Raw264.7培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,PBMC培養于含有IL-2(200 U/mL)的X-VIVO培養基中,P/S的濃度為1%。細胞培養在37℃恒溫培養箱中,濕度為95%,CO2體積濃度為5%。

1.3.3 MTS法測定細胞增殖

鋪細胞于96孔板中,細胞密度為2.5×103～10×103,每孔 100 μL。過夜培養后,加入 WK429(給藥組)或 FX1(陽性組),藥物濃度為:0.045 μmol/L、0.137μmol/L、0.411μmol/L、1.234μmol/L、3.703μmol/L、11.110 μmol/L、33.330 μmol/L 和 100 μmol/L。對照組加入等量的完全培養基,每組設兩個復孔。藥物孵育72 h后,每孔加入20 μL MTS,在490 nm波長下用酶標儀測定OD值,統計并分析藥物對細胞活力的影響。

1.4 細胞凋亡實驗

取生長狀態良好的PBMC,調整細胞密度為1.0×106～2.0×106cells/mL,接種于 6 孔板,進行藥物處理。將細胞分為對照組、給藥組和陽性組,其中,對照組加入完全培養基；給藥組加入完全培養基和不同濃度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽性組加入完全培養基和不同濃度的陽性藥物FX1(5 μmol/L 或 10 μmol/L)。處理 48 h,隨后收集細胞于離心管中,800 r/min離心5 min,棄上清,1× PBS 洗滌一次,1× binding buffer(100 μL)重懸細胞。細胞分為不染組(不加染色試劑)、單染碘化丙啶(propidium iodide,PI)組(加入 5 μL PI)、單染Annexin V 組(加入 5 μL Annexin V)以及 PI和 Annexin V雙染組(PI和Annexin V各加入5 μL)。不同染色組細胞混勻后,室溫避光孵育15 min,再加入1×binding buffer(300 μL),用流式細胞儀BD LSRFortessa進行檢測。

1.5 脂多糖和刀豆蛋白A刺激PBMC分泌炎癥因子實驗

取生長狀態良好的PBMC,調整細胞密度為1.0×106～2.0×106cells/mL,接種于 12 孔板,進行藥物處理。將細胞分為空白組、對照組、給藥組和陽性組,其中,空白組加入完全培養基；對照組加入完全培養基和脂多糖(10 μg/mL)；給藥組加入完全培養基、脂多糖(10 μg/mL)和不同濃度的WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽性組加入完全培養基、脂多糖(10 μg/mL)和不同濃度的陽性藥物FX1(5 μmol/L 或 10 μmol/L)。培養 24 h 后收集細胞于離心管中,1 000 r/min離心5 min,收集上清,采用ELISA試劑盒檢測細胞上清中的炎癥因子IL-6和TNF-α。刀豆蛋白A刺激PBMC分泌炎癥因子實驗的操作步驟如上所述,刀豆蛋白A的質量濃度為5 μg/mL,采用ELISA試劑盒檢測細胞上清中的炎癥因子IFN-γ和IL-17A。

1.6 脂多糖刺激Raw264.7細胞分泌炎癥因子和趨化因子實驗

取生長狀態良好的Raw264.7細胞,調整細胞密度為 0.5×106～1.0×106cells/mL,接種于 12 孔板,12 h后進行藥物處理。如方法1.5所述,將細胞分為空白組、對照組、給藥組和陽性組,脂多糖添加水平為100 ng/mL。培養48 h后收集細胞,提取RNA并將其反轉錄成cDNA,采用熒光定量PCR 檢測炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-12p40、TNF-α、CCL2和CCL7的表達。PCR檢測的引物信息如下:IL-1β-F:5′-CACAGAGGATACCACTCCCAACA-3′,IL-1β-R:5′-TCCACGATTTCCCAGAGAACA-3′；IL-6-F:5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′,IL-6-R:5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；IL-12p40-F:5′-TGGTTTGCCATCGTTTTGCTG-3′,IL-12p40-R:5′-ACAGGTGAGGTTCACTGTTTCT-3′；TNF-α-F:5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAG-3′,TNF-α-R:5′-GGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；CCL2和 CCL7基因的引物序列參照文獻[14]。

1.7 體外Tfh細胞形成實驗

1.7.1 脾臟細胞的分離

麻醉處死8～10周齡C57BL/6小鼠,經75%乙醇消毒后,取出小鼠脾臟并將其置于40 μm的濾網上。用注射器內芯充分研磨脾臟,然后用1×MACS緩沖液(1×PBS+2%FBS+2 mmol/L EDTA)沖洗并收集細胞懸液。1 500 r/min離心5 min,棄去上清,加入1×紅細胞裂解液,裂解2 min左右,隨后加入5倍體積的緩沖液終止裂解,用40 μm的濾網過濾去除細胞團塊；將過濾液1 500 r/min離心5 min,棄去上清,再用1×MACS緩沖液重懸細胞,并進行計數。

1.7.2 Tfh細胞形成實驗

分選出初始CD4+T細胞,調整細胞密度為2.0×105～4.0×105cells/mL,鋪 24 孔板,進行藥物處理。將細胞分為對照組、給藥組和陽性組,其中,對照組只加入刺激因子:anti-CD3(5 μg/mL)、anti-CD28(2 μg/mL)、anti-IFN-γ (10 μg/mL)、anti-IL-4(10 μg/mL)、anti-TGF-β (20 μg/mL)、IL-6(100 ng/mL)和IL-21(50 ng/mL)；給藥組加入刺激因子和不同濃度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽性組加入刺激因子和不同濃度的陽性藥物FX1(5 μmol/L或10 μmol/L)。培養72 h后收集細胞進行染色,用流式細胞儀BD LSRFortessa檢測Tfh細胞(CD4+CXCR5+PD-1+)的形成。

1.8 體外GC B細胞形成實驗

從脾臟中分離出單個細胞,然后分選出總B(B220+)細胞,調整細胞密度為 3.0×105～5.0×105cells/mL,鋪24孔板,進行藥物處理。如方法1.5所述,將細胞分為空白組、對照組、給藥組和陽性組。培養72 h后收集細胞進行染色,用流式細胞儀BD LSRFortessa檢測GC B細胞(B220+GL7+)的形成。

1.9 體外漿細胞的分裂和形成實驗

將分選出的總B(B220+)細胞用1×PBS溶液洗滌兩次以除去多余的血清,800 r/min離心5 min,棄去上清,用1×PBS(室溫)重懸細胞,調整細胞密度為 5.0×106～10×106cells/mL,加入 CFSE 染料至終濃度為2 μmol/L,隨后立即混勻細胞懸液,室溫避光孵育10 min。加入4～5倍預冷的完全培養基,冰上孵育5 min,隨后800 r/min離心5 min,棄去上清,重懸細胞,調整細胞密度為3.0×105～5.0×105cells/mL,鋪24孔板,進行藥物處理。將細胞分為空白組、對照組、給藥組和陽性組,其中,空白組加入完全培養基；對照組加入完全培養基、脂多糖(10 μg/mL)和 IL-4(10 ng/mL)；給藥組加入完全培養基、脂多糖(10 μg/mL)、IL-4(10 ng/mL)和不同濃度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽性組加入完全培養基、脂多糖(10 μg/mL)、IL-4(10 ng/mL)和不同濃度的陽性藥物FX1(5 μmol/L或10 μmol/L)。培養72 h后收集細胞進行染色,用流式細胞儀BD LSRFortessa檢測漿細胞的分裂(CFSE)和漿細胞(B220-CD138+)的比例。

1.10 體內生發中心形成實驗

1.10.1 動物免疫實驗

選擇8～10周的C57BL/6小鼠,腹腔注射100 μg NP偶聯的CGG。免疫2 d后隨機分為3組,其中,對照組為溶劑羧甲基纖維素鈉,給藥組為WK429(50 mg/kg),陽性組為FX1(50 mg/kg)。給藥頻率為每天1次,給藥組給藥方式為灌胃給藥,陽性組給藥方式為腹腔注射給藥。連續給藥12 d,免疫后第14天麻醉處死小鼠,取小鼠脾臟放置于1×PBS中。

1.10.2 脾臟細胞的免疫熒光實驗

用OCT包埋脾臟,放入液氮冷凍后置于-80℃保存。在冰凍切片機上將脾臟切成6 μm的薄片,丙酮固定15 min后室溫晾干；PBS洗滌10 min,再用0.1%的Triton-X 100通透10 min,10%的FBS封閉30 min；4℃孵育一抗(PNA+IgD)過夜,PNA的稀釋比例為1︰200,IgD的稀釋比例為1︰500,再用PBST洗3遍,每次3 min,隨后常溫孵育二抗[streptavidin-Cy3+donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488],streptavidin-Cy3的稀釋比例為1︰100,donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488的稀釋比例為1︰300,1 h后回收二抗并同樣用PBST洗3遍,每次3 min；加入防淬滅劑,蓋上蓋玻片,封片后將其置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.10.3 流式細胞術分析實驗

從小鼠脾臟中分離出單個細胞,調整細胞密度為1×106cells/mL。每個樣本取50 μL重懸的細胞,封閉后分別加入50 μL稀釋好的流式抗體(比例為1︰100),用于GC染色的抗體:PerCP/cy5.5-anti-B220、FITC-anti-FAS 和 eFluor 660-anti-GL7；用于Tfh細胞檢測的抗體:PerCP/cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CXCR5和APC-anti-PD-1；用于記憶B細胞檢測的抗體:FITC rat anti-mouse CD38和PE-anti-IgG1；用于漿細胞檢測的抗體:PerCP/cy5.5-anti-B220和APC rat anti-Mouse CD138,4℃避光孵育30 min。加入1 mL的緩沖液終止染色,1 500 r/min離心 5 min,棄去上清,用 300～400 μL緩沖液重懸細胞,并轉移到流式管中,用流式細胞儀BD LSRFortessa檢測Tfh細胞(CXCR5+PD-1+)、GC B 細胞(FAS+GL7+)、記憶 B 細胞(CD38+IgG1+)和漿細胞(B220-CD138+)的變化。

1.11 血清中抗體IgG的檢測

實驗結束時,小鼠眼眶取血,室溫靜置1 h,6 000 r/min離心10 min,吸上層液體(血清)至新的離心管中,按照說明書采用小鼠IgG(total)ELISA試劑盒檢測血清中抗體IgG的含量。

1.12 統計學處理

數據用GraphPad Prism 5軟件進行統計和分析,多組間比較采用單因素方差分析,P值表示差異的顯著性,當P＞0.05時,差異不顯著,標注為ns；在差異顯著的情況下,P＜0.05標注為*,P＜0.01標注為**,P＜0.001標注為***。

2 結果

2.1 小分子化合物WK429的篩選和細胞活性評價

為了檢測目標小分子化合物是否可阻斷BCL6BTB與SMRT的結合,本文構建了HTRF藥物篩選體系,從小分子化合物庫中篩選到活性最好的化合物WK429(圖1)。對于BCL6高表達的人彌漫大B細胞株SUDHL4,WK429明顯抑制其生長；此外,WK429對小鼠腹腔巨噬細胞Raw264.7和 PBMC 的 IC50＞100 μmol/L,表明 WK429 對免疫細胞沒有毒性作用(表1)。

圖1 WK429的化學結構Fig.1 The chemical structure of WK429

2.2 WK429對PBMC的凋亡沒有影響

采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況,實驗結果顯示,與對照組(即 Control組)相比,10 μmol/L WK429給藥組的細胞凋亡比例基本沒有變化(P＞0.05)(圖2)。這表明WK429不影響PBMC的凋亡。

2.3 WK429抑制PBMC分泌炎癥因子

在PBMC的炎癥因子分泌實驗中,與空白組(即Blank組)相比,脂多糖(Control組)刺激明顯促進PBMC分泌炎癥因子IL-6(P＜0.001)和TNF-α(P＜0.01)；而與 Control組相比,10 μmol/L WK429處理后,炎癥因子 IL-6(P＜0.01)和 TNF-α (P＜0.05)的產生明顯降低(圖3A)。此外,在刀豆蛋白A刺激PBMC實驗中,與Blank組相比,刀豆蛋白A(Control組)刺激明顯促進PBMC分泌炎癥因子IFN-γ(P＜0.001)和 IL-17A(P＜0.001)；而與 Control組相比,10 μmol/L WK429處理后,炎癥因子 IFN-γ(P＜0.001)和 IL-17A(P＜0.001)的產生也明顯降低(圖3B)。實驗結果表明在脂多糖或者刀豆蛋白A的刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎癥因子。

表1 WK429的活性評價Table 1 The activity evaluation of WK429

圖2 WK429對PBMC凋亡的影響(A)PBMC細胞凋亡的流式圖；(B)PBMC細胞凋亡的統計圖。ns:P＞0.05 vs.對照組。Fig.2 Effect of WK429 on the apoptosis of PBMCs(A)The apoptotic cells of PBMC were analyzed by flow cytometry；(B)The apoptotic cells of PBMC were calculated.ns:P＞0.05,compared with the control group.

2.4 WK429抑制Raw264.7細胞分泌炎癥因子和趨化因子

在Raw264.7細胞的炎癥因子分泌實驗中,與空白組(即 Blank組)相比,脂多糖(Control組)刺激明顯促進Raw264.7細胞分泌炎癥因子IL-1β(P＜0.001)、IL-6(P＜0.001)、IL-12p40(P＜0.001)和TNF-α (P＜0.001)；而與 Control組相比,10 μmol/L WK429 處理后,炎癥因子 IL-1β (P＜0.001)、IL-6(P＜0.001)、IL-12p40(P＜0.01)和 TNF-α (P＜0.01)的產生明顯降低(圖4A)。此外,與Blank組相比,脂多糖(Control組)刺激明顯促進Raw264.7細胞分泌趨化因子 CCL2(P＜0.001)和 CCL7(P＜0.001)；而與Control組相比,10 μmol/L WK429處理后,趨化因子 CCL2(P＜0.001)和 CCL7(P＜0.001)的表達也明顯下調(圖4B)。實驗結果表明在脂多糖的刺激下,WK429抑制Raw264.7細胞分泌炎癥因子和趨化因子。

圖3 WK429抑制PBMC分泌炎癥因子(A)在脂多糖刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎癥因子IL-6和TNF-α；(B)在刀豆蛋白A刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎癥因子 IFN-γ和 IL-17A。ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.3 WK429 inhibited the production of inflammatory factors in PBMCs(A)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in PBMCs stimulated by lipopolysaccharide；(B)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IFN-γ and IL-17A in PBMCs stimulated by concanavalin A.ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

2.5 WK429體外抑制Tfh細胞的形成

在刺激因子的作用下,對照組(即Control組)中的初始CD4+T細胞明顯分化成Tfh細胞,而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中Tfh細胞(CXCR5+PD-1+)的比例明顯降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1陽性組Tfh細胞的比例(圖5)。實驗結果表明WK429體外抑制Tfh細胞的形成。

2.6 WK429體外抑制GC B細胞的形成

采用流式細胞術檢測體外培養條件下GC B細胞的形成情況,實驗結果顯示,與空白組(即Blank組)相比,脂多糖(Control組)處理下GC B細胞(B220+GL7+)的比例明顯增加(P＜0.001),而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中GC B細胞的比例明顯降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1陽性組GC B細胞的比例(圖6)。實驗結果表明WK429體外抑制GC B細胞的形成。

2.7 WK429體外抑制漿細胞的分裂和形成

采用流式細胞術檢測體外培養條件下漿細胞的分裂和形成,實驗結果顯示,與空白組(即Blank組)相比,脂多糖(Control組)處理下峰形圖左移且峰的數目明顯增加(P＜0.01),這表示漿細胞的分裂能力增強；而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中峰形圖右移并且峰的數目顯著減少(P＜0.01),幾乎是單一峰形,基本恢復到Blank組的水平,這表示漿細胞的分裂能力顯著降低(圖7A,C)。此外,與Blank組相比,Control組中漿細胞(B220-CD138+)的比例明顯增加(P＜0.001),而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中漿細胞的比例明顯降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1陽性組漿細胞的比例(圖7B,D)。實驗結果表明WK429體外抑制漿細胞的分裂和形成。

2.8 WK429體內抑制Tfh細胞和GC B細胞的形成

動物免疫后第14天,GC形成達到高峰,取小鼠脾臟檢測Tfh細胞和GC B細胞的形成情況。流式細胞術分析結果表明,與單純的羧甲基纖維素鈉(Control組)處理相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中Tfh細胞(CXCR5+PD-1+)的比例明顯降低(P＜0.01),并且顯著低于50 mg/kg FX1陽性組的比例(P＜0.05)(圖 8A,C)；此外,與 Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中GC B細胞(FAS+GL7+)的比例也明顯降低(P＜0.01),并與50 mg/kg FX1陽性組的比例相當(圖8B,D)；但是,與50 mg/kg WK429給藥組相比,50 mg/kg FX1陽性組脾臟中總B細胞的比例顯著降低(P＜0.05)(圖8E)。因此,WK429可抑制脾臟中Tfh細胞和GC B細胞的形成。

2.9 WK429體內抑制生發中心的形成

動物免疫后第14天,取小鼠脾臟進行免疫熒光實驗以檢測GC的形成。PNA是GC特異表達的糖蛋白,可以用于GC染色,IgD可用于總B細胞染色。與流式細胞術結果一致,免疫熒光結果表明,與Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中GC的面積(圖9A黃色箭頭所指)明顯減少(P＜0.001),并且低于50 mg/kg FX1陽性組脾臟中GC的面積(圖9)。因此,免疫熒光實驗結果同樣證明WK429可體內抑制GC的形成。

圖4 在脂多糖刺激下WK429抑制Raw264.7細胞分泌炎癥因子和趨化因子(A)在Raw264.7細胞中,WK429抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α的表達；(B)在Raw264.7細胞中,WK429抑制趨化因子 CCL2 和 CCL7 的表達。ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.4 WK429 inhibited inflammatory factor and chemokine secretion in Raw264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide(A)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IL-1β,IL-6,IL-12p40 and TNF-α in Raw264.7 cells；(B)WK429 inhibited the expression of chemokines CCL2 and CCL7 in Raw264.7 cells.ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

2.10 WK429體內抑制漿細胞的形成和抗體IgG的產生

圖5 WK429體外抑制Tfh細胞的形成(A)WK429抑制Tfh細胞形成的流式圖；(B)WK429抑制Tfh細胞形成的統計圖。ns:P＞0.05 vs.對照組；*:P＜0.05 vs.對照組；**:P＜0.01 vs.對照組；***:P＜0.001 vs.對照組。Fig.5 WK429 inhibited the formation of Tfh cells in vitro(A)The rate of CXCR5+PD-1+Tfh cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of Tfh cells was calculated.ns:P＞0.05,compared with the control group；*:P＜0.05,compared with the control group；**:P＜0.01,compared with the control group；***:P＜0.001,compared with the control group.

圖6 WK429體外抑制GC B細胞的形成(A)WK429抑制GC B細胞形成的流式圖；(B)WK429抑制GC B細胞形成的統計圖。*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.6 WK429 inhibited the formation of GC B cells in vitro(A)The rate of B220+GL7+GC B cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of GC B cells was calculated.*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

動物免疫后第 14天,取小鼠脾臟檢測漿細胞的形成情況。流式細胞術分析結果表明,與Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中記憶B細胞的比例不變(P＞0.05),這表示WK429不影響記憶B細胞的形成(圖10A,C)；但是,漿細胞的比例明顯降低(P＜0.01),從0.90%下降到0.26%,并且低于50 mg/kg FX1陽性組脾臟中漿細胞的比例(0.33%)(圖10B,D),這表明WK429抑制漿細胞的形成。此外,與Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組中抗體IgG的含量明顯降低(P＜0.05),這表示抗體IgG的產生受到抑制(圖10E)。以上實驗結果表明,WK429抑制漿細胞的形成和抗體IgG的產生。

圖7 WK429體外抑制漿細胞的分裂和形成(A)WK429抑制漿細胞分裂的流式圖；(B)WK429抑制漿細胞形成的流式圖；(C)WK429抑制漿細胞分裂的統計圖；(D)WK429抑制漿細胞形成的統計圖。**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.7 WK429 inhibited the division and formation of plasma cells in vitro(A)The division of plasma cells was analyzed by CFSE；(B)The rate of plasma cell was analyzed by flow cytometry；(C)The division of plasma cells was calculated；(D)The rate of plasma cells was calculated.**:P＜0.01；***:P＜0.001.

3 討論

目前,研究者在多種自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)和重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)等患者或動物模型中均發現GC的形成和自身抗體的產生[15～16,20]。Tfh細胞是一種新發現的T細胞亞群,專門用于刺激GC的形成以及在GC中選擇高親和力的B細胞,有助于抗體產生[21～23]。針對Tfh細胞在自身免疫性疾病中的作用,人們主要在小鼠模型中進行探索,研究表明易患疾病的小鼠中存在大量的Tfh細胞[24]。此外,研究者發現循環Tfh細胞中BCL6的表達與系統性紅斑狼瘡全身疾病的活動呈正相關[25]。在Tfh細胞分化過程中,BCL6表達上調,缺失BCL6的T細胞不能分化為Tfh細胞,而持續性表達BCL6可以增強Tfh細胞的分化能力。此外,增殖后的GC B細胞從暗區遷移到亮區,在這里,Tfh細胞幫助GC B細胞進一步進行抗體類別轉換和陽性細胞選擇[23,26～28]。Tfh細胞和GC B細胞都是GC反應不可或缺的,在這兩種細胞類型中BCL6的缺失會導致GC反應的終止[29]。

圖8 WK429體內抑制Tfh細胞和GC B細胞的形成(A)WK429抑制Tfh細胞形成的流式圖；(B)WK429抑制GC B細胞形成的流式圖；(C)WK429抑制Tfh細胞形成的統計圖；(D)WK429抑制GC B細胞形成的統計圖；(E)WK429對總B細胞比例的影響。*:P＜0.05；**:P＜0.01。Fig.8 WK429 inhibited the formation of Tfh cells and GC B cells in vivo(A)The rate of CXCR5+PD-1+Tfh cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of B220+GL7+FAS+GC B cells was analyzed by flow cytometry；(C)The rate of Tfh cells was calculated；(D)The rate of GC B cells was calculated；(E)Effect of WK429 on the rate of total B cells.*:P＜0.05；**:P＜0.01.

越來越多的研究表明,BCL6是一個潛在的藥物靶點[30]。在GC反應過程中,BCL6的基因發生易位和點突變,導致BCL6蛋白持續性高表達,從而促進B細胞惡性增殖,驅動GC衍生淋巴瘤的發生[9]。在腫瘤中,阻斷BCL6-BTB與其轉錄共抑制子之間的蛋白質-蛋白質相互作用是治療彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)的有效策略[31]。近年來,BCL6抑制劑不斷涌現[32～38],但大部分都是針對腫瘤方面的研究,而且目前BCL6抑制劑也存在諸多問題,比如:細胞水平活性低、生物利用度差和溶解性差等。大部分BCL6抑制劑只有體外數據,體內數據尚未報道。盡管陽性化合物FX1在體內外均存在抗腫瘤活性,但是其溶解度不高。因此,本文以BCL6為靶點,開發針對BCL6BTB結構域的新型高效的小分子抑制劑。

圖9 WK429體內抑制生發中心的形成(A)WK429抑制生發中心形成的免疫熒光圖(標尺:100 μm)；(B)WK429抑制生發中心形成的的統計圖。***:P＜0.001 vs.對照組。Fig.9 WK429 inhibited the formation of GCs in vivo(A)Representative staining of GC was analyzed by immunofluorescence(scale bar:100 μm)；(B)The areas of GC was calculated.***:P＜0.001,compared with the control group.

通過HTRF篩選體系,我們從小分子化合物庫篩選到WK429。在體外,WK429能夠抑制PBMC產生炎癥因子 IL-6、TNF-α、IFN-γ 和 IL-17A,抑制Raw264.7細胞產生炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α,表明WK429具有抑制炎癥的作用,這與陽性化合物FX1的抗炎作用一致。研究表明,BCL6抑制劑FX1能夠降低炎癥因子的產生,減弱巨噬細胞的浸潤活性,并提高患有膿毒癥小鼠的存活率[39]。在體內動物實驗中,WK429不僅抑制Tfh細胞和GC B細胞的形成,而且顯著降低漿細胞的形成和抗體IgG的產生,表明WK429通過對Tfh細胞和GC B細胞的影響,抑制GC反應,最終起到調節體液免疫反應的作用。與陽性藥物FX1腹腔注射給藥相比,WK429可以口服給藥,更具有成藥的潛力。此外,與WK429給藥組相比,陽性藥物FX1明顯影響總B細胞的形成。雖然存在BCL6多肽類抑制劑BPI-1治療系統性紅斑狼瘡的個例報道,但是多肽屬于大分子藥物,而大分子藥物一般作用于細胞表面的靶點,抑制蛋白質相互作用,特異性強,不能口服,難以進入細胞內,即使改造后可以進入細胞內,多肽類藥物的費用也較高。從市場份額來看,小分子藥物占有率達70%,而且小分子化合物可以口服,能夠進入細胞內作用于胞內靶點。總的來講,本研究系統性地評價了小分子化合物WK429抑制炎癥和降低體液免疫反應的作用,具有為體液免疫反應過強的自身免疫性疾病的預防或治療提供新策略的潛力。

圖10 WK429體內抑制漿細胞的形成和抗體IgG的產生(A)記憶B細胞的流式圖；(B)WK429抑制漿細胞形成的流式圖；(C)記憶B細胞占比的統計圖；(D)WK429抑制漿細胞形成的統計圖；(E)WK429抑制抗體IgG產生。ns:P＞0.05 vs.對照組；*:P＜0.05 vs.對照組；**:P＜0.01 vs.對照組。Fig.10 WK429 inhibited the formation of plasma cells and the production of IgG antibody in vivo(A)The rate of CD38+IgG1+memory B cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of B220-CD138+plasma cells was analyzed by flow cytometry；(C)The rate of memory B cells was calculated；(D)The rate of plasma cells was calculated；(E)WK429 inhibited the production of IgG antibody.ns:P＞0.05,compared with the control group；*:P＜0.05,compared with the control group；**:P＜0.01,compared with the control group.