嵌合蛛絲蛋白Flag-MaSp1重復模塊的表達及二級結構分析

田露陽,孟 清,林 瑛

(東華大學化學化工與生物工程學院,中國上海201620)

蜘蛛絲是一種綜合性能優越的天然生物材料,具有優異的機械強度和生物學特性。與蠶絲和目前的人造纖維材料相比,蜘蛛絲有著更為巨大的潛在應用價值,在生物材料和組織工程等領域具有廣闊的應用前景[1～4]。

圓網蜘蛛具有7種類型的特殊分泌腺,它們分泌產生7種具有不同特定功能的蛛絲和膠狀物質[4],這些功能包括防止墜落、束縛獵物、編織蛛網、包裹卵袋等[5～6]。不同類型的蛛絲蛋白在氨基酸序列、物理性質及功能上各不相同[7]。蛛絲蛋白的一級結構均包括高度保守的非重復的N端(N-terminal domain,NT)、C 端(C-terminal domain,CT)以及占比達90%以上的重復區域[8]。蛛絲蛋白的機械性能主要與重復模塊(repetitive module,R)的序列有關[8～9]。

在7種類型的蛛絲蛋白中,鞭狀腺絲蛋白(flagelliform spidroin,Flag)的一級結構具有3個特征:1)含有多個Gly-Pro-Gly-Gly-X結構域；2)含有多個帶電和親水性氨基酸的高度保守間隔區；3)具有非重復的C端,這些結構的組合賦予鞭狀腺絲最高的彈性,使其可以拉伸至自身長度的 200%[10～11]。主壺腹腺絲蛋白 1(major ampullate spidroin,MaSp1)的氨基酸序列分為三類,包括多聚丙氨酸的結構域(poly Ala/Gly-Ala)、富含甘氨酸的結構域(Gly-Gly-X)以及非重復的N端和C端[7]。Gly-Gly-X參與形成的310-螺旋在β-折疊片層之間以及蛋白質分子中相鄰的Gly-Gly-X螺旋之間起連接作用,以促進纖維的排列[12]。Poly-Ala自發形成反向平行的β-折疊,賦予拖絲優越的機械性能[13],這與其他蛛絲蛋白中的報道相一致,成絲過程中由無序及其他結構形成的β-折疊結構,被認為是絲纖維具有高拉伸強度的原因[14～15]。Teulé等[16]構建了含Flag和MaSp2共有重復序列的嵌合蛋白,并發現嵌合蛋白共有重復序列的總體結構決定了纖維的機械性能。因此,為制備具有人們所需機械性能的嵌合蛛絲纖維,了解嵌合蛛絲蛋白的二級結構至關重要。

本文首先構建重組蛋白嵌合體,它包含長度相近的兩個模塊,即Flag蛋白的重復模塊與MaSp1蛋白的重復模塊。將重組蛋白嵌合體純化后去除外源標簽,并利用手工拉絲的方法制備嵌合絲纖維。然后,使用圓二色譜(circular dichroism spectrum,CD spectrum)及傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)對成絲前后的嵌合蛛絲蛋白的二級結構進行分析；利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)對絲纖維的表面形態進行表征,進而分析并預測其潛在的力學性質。研究結果為制備嵌合蛛絲纖維提供了研究方向和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

分子克隆使用的DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒等均購于上海生工生物工程股份有限公司；DNA分子量標準Trans 2K PlusⅡ購于北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶以及T4 DNA連接酶購于美國ThermoFisher Scientific公司；PCR中用到的Taq DNA聚合酶購于南京諾唯贊生物科技有限公司。重組蛋白質表達所使用的宿主菌E.coli T1和BL21(DE3)購于北京全式金生物技術有限公司。重組蛋白質純化所用的鎳柱購于德國Qiagen公司。Western-blot所用的PVDF膜購于德國Merck公司,ECL化學發光底物購于美國Invitrogen公司,6×His標簽的特異性抗體及HRP標記的羊抗鼠IgG二抗購于天津邁基生物科技有限公司。pGHScRp1及pGH-MaSp1R質粒委托上海捷瑞生物工程有限公司進行全基因合成。引物合成和DNA測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 重組質粒的構建

以pGHScRp1質粒(含FlagR序列)為模板,表1中的Flag-P1及Flag-P2為引物,PCR擴增得到FlagR片段。PCR條件如下:95℃預變性5 min；95℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃補平10 min,循環數30個。對PCR產物進行BglⅡ和XhoⅠ雙酶切,對本課題組改造的pET-32a表達載體pEHS(含6×His-SUMO標簽)及上述獲得的FlagR片段同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,使用T4 DNA連接酶將片段和載體相連接,得到過渡質粒pEHS-FlagR。根據大腹園蛛(Araneus ventricosus)MaSp1的mRNA序列(GenBank登錄號:JN857964.2),取一個長696 bp、編碼232個氨基酸的完整重復區,記作MaSp1R,對完整序列進行大腸桿菌密碼子優化后委托上海捷瑞生物工程有限公司進行全基因合成,并在兩端加入BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點。對合成質粒pGH-MaSp1R及過渡質粒pEHS-FlagR同時進行BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切,隨后連接得到重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R。

1.3 嵌合蛛絲蛋白的表達與純化

將重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R轉化至E.coli BL21(DE3)中,37℃培養過夜。挑取單克隆,接種于含氨芐青霉素(ampicillin,Amp)抗性的10 mL LB培養基中,于37℃、180 r/min條件下過夜培養；將菌種轉接于Amp(終質量濃度為100 μg/mL)抗性的LB培養基中,培養至OD600為0.6～0.8,隨后加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)進行誘導表達,誘導條件為:20℃,180 r/min,過夜。在4℃條件下4 000 r/min離心20 min收集菌體,并用50 mL 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)將其充分重懸；細胞重懸液使用高壓破碎儀(JN-3000 plus,JINBO)進行細胞破碎(120～130 MPa)；隨后,4 ℃、10 000 r/min離心30 min收集上清液。根據Qiagen鎳柱使用說明進行蛋白質的純化:將上清液與Ni2+-NTA柱子置于冰上孵育1 h,使其充分結合；隨后使用沖洗緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L咪唑、300 mmol/L NaCl,pH 8.0)對柱子進行沖洗；最后使用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L咪唑、300 mmol/L NaCl,pH 8.0)對蛋白質進行洗脫并收集。向蛋白質溶液中加入SUMO蛋白酶(體積比100︰1)并在4℃條件下過夜透析于20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中,以去除NaCl以及咪唑。透析后的蛋白質溶液再次與鎳柱結合,收集得到嵌合蛛絲蛋白。

1.4 嵌合蛛絲蛋白的檢測

使用紫外分光光度計測量280 nm處的吸光度,以確定嵌合蛛絲蛋白的濃度和產率；使用15%的SDS-PAGE檢測蛋白質的表達純化情況,并通過考馬斯亮藍R-250染色后采用Image J進行分析,以確定蛋白質的純度；通過Western-blot檢測嵌合蛛絲蛋白有無標簽污染:15%的SDSPAGE凝膠300 mA恒流轉膜60 min后,先后使用6×His標簽的特異性抗體及二抗孵育結合,隨后進行ECL底物反應,暗室顯色后壓片掃描保存。

1.5 圓二色譜分析

嵌合蛛絲蛋白在4℃條件下過夜透析于10 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 8.0)后,使用超濾離心管進行濃縮,并將濃縮產物溶于pH 7.0的10 mmol/L磷酸緩沖液中。將200 μL蛋白質溶液加入0.1 cm光程的200 μL石英比色皿中,使用Chirascan光譜儀(Applied Photophysics Ltd.,England)于25℃條件下記錄260～190 nm的嵌合蛛絲蛋白FlagR-MaSp1R溶液的CD光譜。掃描步長為0.5 nm,響應時間為1 s,帶寬為1 nm。CD光譜取3次掃描的平均值。測試蛋白質樣品的終質量濃度為0.12 mg/mL。

1.6 手工拉絲

參照文獻[11]報道的方法進行絲纖維的制備,主要操作如下:室溫下將200 μL純化后的蛋白質溶液(含20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)以適當的質量濃度(0.8～1.0 mg/mL)置于載玻片上,使用小針頭以約6 mm/s的速度連續將絲狀纖維從溶液中拉出,并纏繞在特制的紙片上。制備好的樣品可用于后續測試。

1.7 傅里葉變換紅外光譜分析

使用Nicolet iN 10 MX傅里葉紅外顯微成像光譜儀(ThermoFisher Scientific,USA)測定嵌合蛛絲纖維位于600～4 000 cm-1范圍內的紅外光譜圖。使用Peakfit v4.12軟件對位于酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)的光譜進行處理,根據子峰面積計算蛋白質二級結構的百分比例。

1.8 掃描電子顯微鏡觀察

使用掃描電子顯微鏡(Phenom XL,USA)觀察嵌合蛛絲纖維的表面形態。選擇5～15 kV電壓和電子背散射衍射(electron backscattering diffraction,EBSD)模式進行觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R的構建

為構建表達嵌合蛛絲蛋白的重組質粒,首先PCR擴增獲取FlagR片段,DNA電泳結果見圖1A,目標條帶與預期大小(728 bp)相符,說明成功擴增獲得FlagR片段。隨后將FlagR片段與pEHS載體進行酶切、連接及轉化,得到過渡質粒pEHS-FlagR,再對過渡質粒及合成質粒(含MaSp1R)進行酶切、連接及轉化,得到重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R。重組質粒的NdeⅠ及XhoⅠ雙酶切鑒定結果如圖1B所示。此外,我們將雙酶切鑒定陽性結果送往上海生工生物工程股份有限公司測序,測序結果證實重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R構建成功。

2.2 嵌合蛛絲蛋白的表達與純化

嵌合蛛絲蛋白所涉及到的不同重復模塊的氨基酸序列見圖2A,Flag和MaSp1的重復模塊均來源于大腹園蛛,模塊的組合方式見圖2B。蛛絲蛋白在大腸桿菌中表達時常以包涵體形式存在,為增加嵌合蛛絲蛋白的可溶性及方便后續純化,在兩種重復模塊序列的N端添加6×His-SUMO標簽。純化后使用SUMO蛋白酶將標簽切除。

圖1 FlagR片段的PCR擴增及重組質粒的酶切鑒定結果(A)FlagR片段PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M:DNA分子量標準,泳道1:陰性對照(使用等體積的H2O作為PCR擴增模板),泳道2:FlagR片段的PCR擴增產物(箭頭所示)；(B)重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R的雙酶切驗證圖譜。M:DNA分子量標準,泳道1:經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后的重組質粒(箭頭所示)。Fig.1 PCR amplification of FlagRfragment and double digestion of the recombinant plasmid(A)PCR amplification product of FlagRDNA was separated on agarose gel electrophoresis.M:DNA marker,Lane 1:Negative control(equal volume of H2O was used as PCR amplification template),Lane 2:FlagRPCR amplification product(as indicated by the arrow)；(B)Double digestion map of recombinant plasmid pEHS-FlagR-MaSp1R.M:DNA marker,Lane 1:Recombinant plasmid after double digestion with NdeⅠand XhoⅠ(as indicated by the arrow).

圖2 嵌合蛛絲蛋白的氨基酸序列及示意圖(A)嵌合蛛絲蛋白的氨基酸序列組成；(B)嵌合蛛絲蛋白的模塊示意圖。Fig.2 Amino acid sequence and schematic diagram of chimeric spidroin(A)Amino acid sequence of chimeric spidroin；(B)Schematic diagram of chimeric spidroin.

將重組質粒pEHS-FlagR-MaSp1R轉化至表達菌株,并用IPTG誘導其表達重組蛋白質。重組蛋白質的誘導表達結果見圖3A,與誘導前的菌裂解液(圖3A泳道1)相比,誘導后的菌裂解液(圖3A泳道2)在45 kD到66.2 kD之間有一顯著增強的表達條帶,且該條帶大小與預期重組蛋白質的大小相符合。此外,從圖3A的電泳結果可知,上清(圖3A泳道4)中含有較多的重組蛋白質,而沉淀(圖3A泳道3)中僅有少量重組蛋白質存在,說明重組蛋白質主要以可溶的形式存在于上清中。表達產物經鎳柱親和純化后的SDS-PAGE檢測結果如圖3B泳道1所示,帶有6×His-SUMO標簽的重組蛋白質純度較高。為減少標簽對蛋白質結構及功能的影響,將鎳柱親和純化后的產物進行SUMO蛋白酶消化,以去除6×His-SUMO標簽。SUMO蛋白酶消化液的SDS-PAGE檢測結果如圖3B泳道2所示。對消化液再次進行鎳柱親和純化,以去除外源標簽及剩余的SUMO蛋白酶,收集的流穿液即為純化后的嵌合蛛絲蛋白。去除標簽后的嵌合蛛絲蛋白的相對分子質量與理論值35.355 kD相符,且純度好(圖3B泳道3)。將圖3B泳道1～3的蛋白質樣品進行Western-blot檢測,結果如圖3C所示,說明嵌合蛛絲蛋白無6×His-SUMO標簽污染(圖3C泳道3)。

圖3 嵌合蛛絲蛋白的SDS-PAGE及Western-blot分析結果(A)重組蛋白質(含有6×His-SUMO標簽)誘導表達的SDS-PAGE結果。泳道1:誘導前,泳道2:誘導后,泳道3:沉淀,泳道4:上清；(B)嵌合蛛絲蛋白純化后的SDS-PAGE結果。泳道1:重組蛋白質(含有6×His-SUMO標簽),泳道2:SUMO蛋白酶消化液,泳道3:純化后的嵌合蛛絲蛋白；(C)嵌合蛛絲蛋白純化后的Western-blot分析結果。泳道1:重組蛋白質(含有6×His-SUMO標簽),泳道2:SUMO蛋白酶消化液,泳道3:純化后的嵌合蛛絲蛋白。泳道M均為蛋白質分子量標準。Fig.3 SDS-PAGE and Western-blot analysis of chimeric spidroin(A)SDS-PAGE results of induced expression of recombinant protein(containing 6×His-SUMO tag).Lane 1:Non-induced,Lane 2:Induced,Lane 3:Precipitation,Lane 4:Supernatant；(B)SDS-PAGE results of purified chimeric spidroin.Lane 1:Recombinant protein(containing 6×His-SUMO tag),Lane 2:SUMO protease digestion solution,Lane 3:Purified chimeric spidroin；(C)Western-blot analysis of purified chimeric spidroin.Lane 1:Recombinant protein(containing 6×His-SUMO tag),Lane 2:SUMO protease digestion solution,Lane 3:Purified chimeric spidroin.All the M lanes represent protein markers.

2.3 嵌合蛛絲蛋白的二級結構分析

為了解嵌合蛛絲蛋白溶液狀態下的二級結構特征,我們測定了嵌合蛛絲蛋白在pH 7.0磷酸鹽溶液條件下的CD光譜,結果見圖4。從圖中可以觀察到,FlagR-MaSp1R蛋白在192 nm處呈現正吸收峰,在208 nm及222 nm處呈現負吸收峰,均為典型的α-螺旋特征吸收峰。為進一步確定溶液狀態下各二級結構的百分含量,使用CDNN v2.1對CD光譜進行分析,結果見表2,α-螺旋占比為47.1%,表明在溶液狀態下嵌合蛛絲蛋白以α-螺旋構象為主。

為了解手工拉絲獲得的絲纖維的二級結構,我們對其進行了FTIR測定,FTIR位于酰胺Ⅰ帶的光譜結果見圖5。從圖中可以觀察到,β-折疊的區域峰集中在 1 610.1 cm-1、1 620.0 cm-1、1 628.8 cm-1、1 637.2 cm-1及1 694.3 cm-1附近；無規卷曲集中在1 644.6 cm-1附近；α-螺旋集中在1 653.3 cm-1附近；β-轉角集中在 1 661.7 cm-1、1 670.1 cm-1、1 679.3 cm-1及1 687.3 cm-1附近。絲纖維二級結構的百分含量見表2。結合圓二色譜分析得到的二級結構百分含量結果可知,絲纖維中α-螺旋的百分含量明顯下降,β-折疊與β-轉角明顯增多,表明在成絲過程中蛋白質的二級結構發生了由α-螺旋向β-折疊的轉變。

2.4 嵌合蛛絲纖維的形態特征

為了解嵌合蛛絲纖維的形態特征,使用SEM對絲纖維的表面形態進行觀察。圖6的顯微結果顯示,1 000倍條件下,絲纖維十分纖細(圖6A)；放大絲纖維的局部至5 000倍時,可以清晰地看到絲纖維的輪廓(圖6B)；選取視野的中心位置繼續放大至10 000倍,可以觀察到絲纖維具有類似天然蛛絲纖維的形態,直徑1～2 μm,接近天然蛛絲纖維的尺寸,且整體較為光滑均勻(圖6C)。

圖4 嵌合蛛絲蛋白的圓二色譜分析Fig.4 CD analysis of chimeric spidroin

圖5 嵌合蛛絲蛋白位于酰胺Ⅰ帶的傅里葉變換紅外光譜Fig.5 FTIR of chimeric spidroin in amideⅠband

表2 FlagR-MaSp1R成絲前后的二級結構百分含量Table 2 The contents of secondary structure before and after FlagR-MaSp1Rsilk formation

3 討論

已有研究報道,蛛絲蛋白可以在一定條件下自組裝形成絲狀纖維。Xu等[17]研究發現葡萄狀腺絲蛋白(aciniform spidroin 1,AcSp1)至少需要兩個重復模塊才可以自組裝形成絲纖維。Zhou等[18]將來源于不同種蜘蛛的MaSp1的NT、次壺腹腺絲蛋白(minor ampullate spidroin,MiSp)的CT及 AcSp1的重復模塊進行了組合,所得到的嵌合蛛絲蛋白可以自組裝形成絲纖維。在本研究中,我們設計了同種蜘蛛不同類型絲蛋白重復模塊相嵌合的嵌合蛛絲蛋白,并在大腸桿菌中獲得高效表達(約50 mg/L)(圖3B)。純化后不含外源標簽的蛋白質可于室溫中性pH生理溶液中經手工拉絲獲得絲狀纖維,表明在不含有蛛絲蛋白的NT及CT的條件下,不同類型的絲蛋白也能夠發生自組裝現象。CD光譜分析表明,嵌合蛛絲蛋白溶液在室溫及中性pH條件下的二級結構以α-螺旋為主(圖4),這與已有報道提及的蛛絲蛋白溶液狀態下的二級結構主要為α-螺旋構象[19]相吻合；FTIR酰胺Ⅰ帶的蛋白質二級結構分析結果顯示,手工拉絲獲得的絲纖維以β-折疊與β-轉角為主(圖5),表明嵌合蛛絲蛋白的成絲過程具有與其他蛛絲蛋白[17～18]類似的二級結構變化,即蛋白質的二級結構由α-螺旋向β-折疊轉變。現有研究顯示,Flag中含有的特征模塊Gly-Pro-Gly-Gly-X結構域成絲后進一步形成β-轉角結構[10]；MaSp1中含有的poly-Ala模塊較長,且占比高,可產生大量的β-折疊,從而賦予絲纖維優越的強度[20]；Flag及MaSp1中共有的Gly-Gly-X結構域形成的310-螺旋結構與Gly-Pro-Gly-Gln-X一同形成α-螺旋和β-轉角的混合結構,并進一步形成β-spiral構象,構成無定型區域,共同賦予絲纖維良好的彈性[11,21]。本研究所獲得的嵌合蛛絲纖維的二級結構中β-折疊占比高達約32%,β-轉角占比高達約40%(表2),表明在嵌合蛛絲纖維中,不同類型的絲蛋白仍保持各自的結構特征,并很可能表現出優異的抗拉伸強度及延展性。同時,本研究手工制得的嵌合蛛絲纖維與相同方法獲得的重組蛛絲纖維[18]直徑相近,且表面形態整體光滑,相比濕法紡絲[22～23],更加綠色環保,直徑也更接近天然(圖6)。

圖6 嵌合蛛絲纖維的掃描電子顯微鏡圖Fig.6 SEM image of chimeric spider silk fibers

現有的研究絕大多數局限于同種蜘蛛相同類型蛋白質的重復模塊的疊加[17,24],本研究將同種蜘蛛的不同類型絲蛋白的重復模塊相嵌合,在不含蛛絲蛋白的NT及CT的情況下嵌合蛛絲蛋白仍可以自組裝形成絲纖維,且絲纖維表面形態均勻光滑。在嵌合蛛絲蛋白成絲后的二級結構中β-折疊的百分含量較高,說明嵌合蛛絲纖維很可能具有出色的機械性能,本研究可為產生具有優越機械性能的嵌合蛛絲纖維提供研究方向和理論基礎。未來研究人員可以通過增加嵌合蛛絲蛋白重復模塊的數量及改變優化紡絲過程的各項參數來制備嵌合蛛絲纖維,并更好地應用在現代科技生活中,如生物醫學、組織工程、航空航天以及軍事等眾多領域。