人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成骨及與膠原-明膠海綿載體復(fù)合的實(shí)驗(yàn)研究

王芳 宋慶高 郭佳男 陳尚 何葦 鄒亞莉

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴州 遵義 563000)

牙槽突裂常與唇腭裂并發(fā)，是最常見的先天顱面部發(fā)育畸形之一，但目前的治療手段效果不盡人意。近年來，隨著組織工程及干細(xì)胞技術(shù)的興起，學(xué)界普遍認(rèn)為這將有望是修復(fù)牙槽突裂的新方法。而有研究發(fā)現(xiàn)，羊膜來源的干細(xì)胞免疫原性低，具有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)來源豐富、擴(kuò)增能力強(qiáng)、易于富集，且無醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的爭(zhēng)議[2-3]，具有作為修復(fù)人體組織的種子細(xì)胞的特性和潛力。由于先天性牙槽突裂往往在出生時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，若此時(shí)患者自身的羊膜在其后期的修復(fù)上可以得到充分的利用，相較于其他來源的干細(xì)胞就可以不用考慮免疫排斥反應(yīng)的問題。因此，本研究以人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(human amniotic mesenchymal cells，hAMCs)及經(jīng)成骨誘導(dǎo)的hAMCs作為種子細(xì)胞，并將其負(fù)載于膠原-明膠海綿上進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，為將來動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用修復(fù)牙槽突裂缺損提供前期體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 (1)組織標(biāo)本的采集和實(shí)驗(yàn)分組:經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及產(chǎn)婦知情同意后，從遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)室無菌采集8例足月剖宮產(chǎn)胎盤，hAMCs的分離培養(yǎng)在采集后2 h內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)至第三代后隨機(jī)分為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的正常對(duì)照組和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的成骨誘導(dǎo)分化組。(2)實(shí)驗(yàn)試劑為：膠原酶Ⅱ(美國(guó)Sigma公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Amreseo公司)，DNaseⅠ(美國(guó)Worthington公司)，F(xiàn)BS(美國(guó)Gibco公司)，L-glutamine(美國(guó)Hyclone公司)，L-DMEM(美國(guó)Gibco公司)，人單抗CD29-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD166-FITC、CD34-PE(美國(guó)BD公司)，β-甘油磷酸鈉(美國(guó)Sigma公司)，地塞米松(瑞士Alexis公司)，維生素C(美國(guó)Sigma公司)，明膠海綿(中國(guó)南京金陵制藥廠)。(3)實(shí)驗(yàn)儀器為：倒置相差顯微鏡(CX40RF400，日本Olympus公司)，自動(dòng)顯微照相裝置(PM20-35，日本Olympus公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(3141，美國(guó)Forma公司)，流式細(xì)胞儀(FACS calibur，美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑的配置 L-DMEM培養(yǎng)基:低糖型DMEM培養(yǎng)基干粉1包及NaHCO33.7g，將其溶于1 000 mL超純水中，混勻并調(diào)pH值至7.25，過濾除菌，分裝，4℃保存；10% EDTA-2Na:EDTA 100 g及NaOH 15g，將其溶于450 mL蒸餾水(60-70℃)，攪拌直至完全溶解，加入0.2M的PBS 500 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.3，蒸餾水定容為1 000 mL，常溫保存；培養(yǎng)基I:L-DMEM 87 mL，10% FBS(1 mol)，2 mLL-谷氨酰胺，100 u/mL青霉素，0.1mg/mL鏈霉素；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基:培養(yǎng)基I中加入100 nmol/L地塞米松、50 ug/mL維生素C和10 nmol/L β-甘油磷酸鈉。

1.2.2hAMCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 用機(jī)械法及酶分離法得到原代hAMCs，培養(yǎng)于培養(yǎng)基I中，培養(yǎng)至第三代用波形蛋白標(biāo)記后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，另外同時(shí)用多色熒光標(biāo)記后(熒光標(biāo)記人單抗CD73-PE、CD44-PE、CD45-PerCP、CD34-PE、CD29-PE-Cy5、CD49d -FITC、CD166-PE)，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行分選鑒定，利用Cell Quest軟件進(jìn)行表型分析。

1.2.3hAMCs的成骨誘導(dǎo)及鑒定 將第三代hAMCs以5×105個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待其生長(zhǎng)密度達(dá)到80-90%的面積后，棄去培養(yǎng)基，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，每隔3 d更換培養(yǎng)基，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。誘導(dǎo)21 d后，利用茜素紅進(jìn)行染色檢測(cè)鈣鹽沉積，顯微鏡下觀察并照相。培養(yǎng)瓶中細(xì)胞用于后續(xù)膠原-明膠海綿載體復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4hAMCs與膠原-明膠海綿載體的復(fù)合 將膠明膠海綿于超凈臺(tái)切成0.3 cm×0.5 cm大小，置于平皿內(nèi)，用鼠尾膠原浸滿24 h，自然晾干后取出，PBS緩沖液沖洗3次后，再用L-DMEM培養(yǎng)基清洗至培養(yǎng)基不變色。將第3代hAMCs以及經(jīng)誘導(dǎo)21 d后的hAMCs消化，制成6×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，吸取100μl細(xì)胞懸液，分別接種于膠原-明膠海綿載體，復(fù)合培養(yǎng)72 h后觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，各組間的數(shù)值以單因素方差分析(One-way ANOVE)，以P<0.05表示結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1hAMCs的表型分析 倒置相差顯微鏡觀察顯示:第三代hAMCs在培養(yǎng)24 h后，大部分貼壁細(xì)胞變?yōu)樗笮位蚨嘟切危臃N3-4 d覆蓋面積可達(dá)90%以上，細(xì)胞呈漩渦狀排列生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果顯示:第三代hAMCs高表達(dá)CD29、CD166 、CD44、CD73、CD49d等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，但不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞和MHC-II類分子表面標(biāo)志(圖1)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:第三代hAMCs波形蛋白染色陽性(圖2)。

2.2hAMCs的成骨分化及鑒定 hAMCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭性(圖3A)逐漸變成多角形(圖3B)，誘導(dǎo)21 d后被茜素紅染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)呈紅染的鈣結(jié)節(jié)(圖3C)。

2.3hAMCs與膠原-明膠海綿復(fù)合體 倒置相差顯微鏡觀察顯示:第三代hAMCs與膠原-明膠海綿載體復(fù)合培養(yǎng)后的24 h內(nèi)，細(xì)胞貼壁能力較弱，晃動(dòng)可導(dǎo)致細(xì)胞脫離。復(fù)合培養(yǎng)72 h后，hAMCs在膠原-明膠海綿上生長(zhǎng)牢靠，且在外力作用下不易脫落，細(xì)胞數(shù)量顯著增多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好(圖4)，膠原-明膠海綿在1周后出現(xiàn)液化降解。

注：A.未作處理的膠原-明膠海綿(×100)；B.hAMCs與膠原-明膠海綿復(fù)合培養(yǎng)后即刻(×100)；C.hAMCs與膠原-明膠海綿復(fù)合培養(yǎng)后72 h(×100)圖4 hAMCs與膠原-明膠海綿復(fù)合培養(yǎng)(箭頭所指為細(xì)胞聚集區(qū))

3 討 論

先天性唇腭裂是人類新生兒最常見的出生缺陷之一，且往往合并有牙槽突裂的發(fā)生，而對(duì)于牙槽突裂的修復(fù)重建目前仍以自體髂骨骨松質(zhì)移植的方法為主，為了避免髂骨量限制及開辟第二術(shù)區(qū)給患者帶來的痛苦，隨著對(duì)組織工程及干細(xì)胞的研究越來越深入，近年來越來越多學(xué)者的研究主張使用組織工程及干細(xì)胞技術(shù)骨修復(fù)牙槽突裂，遺憾的是仍未尋找到一種理想的種子細(xì)胞。自從In't Anker等首先從人羊膜中分離出大量的間充質(zhì)細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)在特定的環(huán)境下可以將其向成骨樣細(xì)胞和脂肪樣細(xì)胞分化以來，hAMCs逐漸為越來越多研究者們所關(guān)注。hAMCs來源于孕婦生產(chǎn)胎兒的遺棄物——胎盤，來源廣泛充足且沒有醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的爭(zhēng)議，有研究報(bào)道從一份人羊膜所分離的hAMCs的細(xì)胞數(shù)量可高達(dá)(6.72±1.21)×107個(gè)，因此數(shù)量上也不存在問題，另有研究表明hAMCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、波形蛋白等，不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞的表面標(biāo)志。我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:本課題組培養(yǎng)的hAMCs中CD73、CD29、CD44、CD166、CD49d高表達(dá)，CD34、CD45不表達(dá)，因此為高純度的hAMCs，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。而且加入一定的成骨誘導(dǎo)劑可使其向成骨細(xì)胞分化，使得hAMCs具有成為利用組織工程手段修復(fù)牙槽突裂的種子細(xì)胞的潛能。

組織工程技術(shù)能否成功與理想的細(xì)胞載體密切相關(guān)。于開濤等的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原處理后的明膠海綿更有利于成骨細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)也證明了明膠海綿是良好的基質(zhì)材料和組織工程骨良好的載體。王海燕等在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的明膠海綿上接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，72 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞粘附在明膠海綿的深面。1周后明膠海綿開始降解，并成功的向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，研究證實(shí)經(jīng)多聚賴氨酸處理過的明膠海綿與BMSCs具有良好的相容性。結(jié)合牙槽突裂修復(fù)的特點(diǎn)，其支架材料的選擇更應(yīng)著重注意良好的可塑性、可降解性及可吸收性，因此，我們采用的是容易獲得，價(jià)格低廉，生物相容性好，可吸收，X線可透射，利于成骨細(xì)胞增殖分化等特點(diǎn)的明膠海綿。為了使細(xì)胞更容易的生長(zhǎng)于支架上，對(duì)明膠海綿采用膠原預(yù)處理。在實(shí)驗(yàn)中觀察到hAMCs種植于膠原-明膠海綿載體上復(fù)合培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡觀察見細(xì)胞成群生長(zhǎng)，48 h后膠原-明膠海綿表面細(xì)胞數(shù)量明顯增多并連成片狀，72 h后細(xì)胞進(jìn)一步增多且晃動(dòng)時(shí)不易脫落。這些發(fā)現(xiàn)都與之前文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致，也表明了hAMCs與膠原-明膠海綿具有較好的生物相容性。同時(shí)，相較于未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的hAMCs，我們觀察到經(jīng)誘導(dǎo)后的hAMCs的增殖速度有所下降，此外在膠原-明膠海綿上的生長(zhǎng)狀況也較差，這可能與hAMCs誘導(dǎo)后其表面標(biāo)志改變及干細(xì)胞特性減弱有關(guān)。

綜上，我們的研究結(jié)果表明hAMCs具有成骨分化的能力，而且與膠原-明膠海綿載體復(fù)合培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好，顯示了hAMCs具有成為組織工程修復(fù)牙槽突裂的種子細(xì)胞的潛能，為后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了前期體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

(本文圖1～3見封三)

圖1 ｈＡＭＣｓ表型的流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果

注：Ａ．波形蛋白染色陽性（如箭頭所示）（×４００）；Ｂ．陰性對(duì)照（×４００）圖2 ｈＡＭＣｓ免疫組織化學(xué)染色

注：Ａ．誘導(dǎo)前（×１００）；Ｂ．誘導(dǎo)中（×１００）；Ｃ．誘導(dǎo)２１ｄ后發(fā)現(xiàn)紅染的鈣結(jié)節(jié)（如箭頭所示）（×１００）圖3 ｈＡＭＣｓ成骨誘導(dǎo)２１ｄ后茜素紅染色結(jié)果