顆粒細胞Cx37的表達與預測卵泡成熟率及IVF-ET妊娠結局的相關性研究

須文馳 陳卓 黃官友 趙淑云△

(1.貴州省人民醫院生殖醫學科,貴州 貴陽 550003;2.貴州醫科大學附屬醫院生殖中心,貴州 貴陽 550002)

當前，全球不孕不育患者已占育齡夫婦的10%[1]，在我國調查顯示該比例高達15%[2]，不孕不育已成為全球性復雜社會學問題的疾病亟待解決。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是治療不孕癥最有效的措施之一，為無數不孕不育患者擁有健康后代帶來了希望[3]。卵泡作為女性生殖的基本單位，其發育是一個復雜的過程。在顯微鏡下卵泡結構為卵母細胞周圍包繞透明帶，其獲取信號的唯一途徑是通過透明帶與其包繞的顆粒細胞形成胞間通訊。細胞之間的通訊有多種方式，其中以細胞間的間隙連接方式進行的細胞間直接的信息交流成為主要細胞間間隙連接通訊。連接蛋白家族的蛋白形成細胞間間隙連接的通道。小鼠中至少發現17種連接蛋白(Connexin，Cx)，這些蛋白的胞內環及C末端的氨基酸序列及長度各異，保證了蛋白功能的多樣性。顆粒細胞可產生多種營養因子，以支持卵泡的生長和成熟，而卵母細胞也可分泌多種作用于顆粒細胞表面的細胞因子對應的受體，其中這些物質轉運及信息傳遞在間隙連接的存在下得以進行[4]。顆粒細胞是卵泡液中最大的細胞群，作為已知存在于卵泡液中的間隙連接蛋白，目前甚少研究Cx37與卵泡成熟的關系，這種細胞間間隙連接蛋白的表達及適時關閉通道，是否會促進卵泡的成熟并獲得優質的卵泡提高輔助生殖技術的成功率，目前尚不清楚。本研究旨在于通過測定卵泡液中顆粒細胞表面Cx37的表達，以評價其對卵泡成熟的質量影響并探討其預測妊娠結局的價值，為進一步提高輔助生殖成功率及活產率提供可能。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年5月至2018年2月在貴州醫科大學生殖中心首次因單純輸卵管因素進行常規IVF-ET治療的患者為研究對象，本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書，并在我院備案。納入標準：年齡≤35歲；月經規律；既往無自然流產史。排除標準：近3個月曾服用甾體類激素類藥物治療；患有子宮內膜病變、內分泌疾病、排卵障礙等疾病；診斷不明原因不孕、免疫性不孕、子宮內 膜異位癥、盆腔結核史等疾病；男性不育。

1.2方法

1.2.1卵巢刺激方案、撿卵 所有患者均采用標準長方案及拮抗劑方案控制性超促排卵。撿卵操作參考本中心操作常規指南，取剩余卵泡液。

1.2.2顆粒細胞采集、孵育 15 mL每離心管中加入6 mL人外周血淋巴細胞分離液；2 000 r/min離心5 min，留取沉淀及上清液吸管吹打，用吸管小心加于分離液之液面上后2 500 r/min離心25 min；用吸管小心吸取第2層環狀乳白色細胞層至另1離心管中，向所得離心管中加入10 mL生理鹽水，混勻細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重復3次。-80度低溫保存。細胞計數：收集標本用PBS重懸，用0.04%臺盼藍染色3 min，細胞計數板計數。共取3個標本檢測，細胞數均約為1～1.5×107個/mL。一抗孵育：在含有10%FCS、1%疊氮化鈉的冰冷PBS溶液中重懸細胞至約1～5×106個/mL；取

兩根離心管，分別標記為A、B兩管，向每管中加入100 uL單細胞懸液；A管中加入1μL Cx37兔多克隆一抗，B管中加入1 μL兔IgG同型對照單克隆抗體作為對照組；室溫下避光孵育30 min；以400 g的速度離心5 min，在4度保存PBS中重懸，共3次。二抗孵育：于A、B兩管中均加入1.5μL FITC標記小鼠抗兔二抗，重懸；黑暗環境下室溫孵育30 min；以400 g的速度離心5 min，PBS溶液中重懸，共3次。

1.2.3流式細胞術測定顆粒細胞上間隙連接蛋白37表達水平 根據標本量體積，設定流式細胞儀自動計數5 000～10 000個。使用同型對照管的細胞調節FSC和SSC熒光通道的光電倍增管的電壓，將自發熒光控制在數軸的1/4范圍內，并根據各標本具體情況適當調整電壓。

2 結 果

2.1Cx37的表達與MⅡ卵率的相關性研究 Cx37的表達與MⅡ卵率呈顯著負相關(r=-0.445，P<0.05)。

2.2兩組患者Cx37表達水平的比較 根據IVF-ET術后14天監測血β-hCG升高情況，將收集標本中已進行移植的患者分為妊娠組及非妊娠組各17例，使用流式細胞儀檢測兩組間Cx37的表達量存在統計學差異(P<0.05)，妊娠組Cx37表達低于未妊娠組。見表1及圖1。

表1 妊娠組與非妊娠組Cx37表達量的比較

圖1 (圖為流式細胞術散點圖，Q3象限藍色散點為Cx37陽性表達，Q4象限紅點散點為實驗陰性對照組分布范圍，Q4象限藍色散點為Cx37陰性表達)

2.3Cx37的表達與hCG日孕酮水平的相關性研究 Cx37的表達與hCG日孕酮水平呈正相關(r=0.301，P<0.05)。

2.4Cx37的表達與hCG日雌二醇水平的相關性研究 Cx37的表達與hCG日雌二醇水平呈正相關(r=0.293，P<0.05)。

2.5患者一般情況的比較 將IVF-ET術后妊娠組與未妊娠組患者一般情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)；MⅡ卵率在組間比較，差異有統計學意義(P<0.05);hCG日孕酮、雌二醇表達在組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 妊娠組與非妊娠組患者一般情況比較

3 討 論

卵泡是卵巢的基本結構和功能單位，由一個卵母細胞及包圍卵母細胞的顆粒細胞及卵泡膜細胞組成，在卵泡成熟過程中，最關鍵的是卵母細胞成熟。其中顆粒細胞間沒有直接的血液供應，卵泡基膜將顆粒細胞、需要與臨近的顆粒細胞及卵母細胞接觸的血管化的卵泡膜細胞分開。故可將與基膜、卵母細胞整合的密集的間隙連接更顯重要[5]。卵泡發育過程中，透明帶允許與之相連的卵丘細胞與卵母細胞通過間隙連接傳遞信息[6,7,8]。同樣，在Tsai等人研究發現卵母細胞減數分裂的啟動與停止、顆粒細胞與卵母細胞之間的營養及代謝產物的傳遞與間隙連接蛋白息息相關[9]。Simon AM的研究顯示，Cx37是連接卵母細胞與其周圍顆粒細胞之間的主要連接蛋白，敲除這一基因，將導致卵母細胞與顆粒細胞之間通訊受阻，導致卵子的凋亡和卵泡的過早黃素化[6]。而在稍后的研究中，Wassarman等人發現Cx37的表達水平與卵母細胞的發育及減數分裂的完成相關[10]。早期有研究表明Cx37與卵泡發育有明顯的相關性，尤其在卵泡發育中期達到最大值[11]。臨床工作中，由于E2的合成與主導卵泡發育有關，使用輔助生殖技術助孕時，外周血E2水平是評價卵泡成熟最有意義的指標、促排卵過程中重要的監測指標，也是反應卵巢反應性的指標之一[12]。孕激素可抑制子宮內膜進一步不斷增殖，使其轉化為分泌的狀態，為生殖胚泡的植入做好準備，同時也可維持妊娠狀態。目前在各項研究中尚無法明確超促排卵過程中，hCG日血孕酮值在超過某一臨界水平后，妊娠率是否會顯著下降。有文獻分析，孕酮水平的升高致臨床妊娠率的下降原因可能是孕酮水平提前升高影響了內膜的容受性[13]，而Bosche E[4]的研究并表示未發現其相關性。陳騫等人[12]的研究中雌二醇水平升高的實驗組在獲卵數增加時，卵子和胚胎的質量并沒有顯著影響。本研究采用流式細胞術分析CX37與MⅡ卵率的相關性，得到MⅡ卵率與Cx37在顆粒細胞膜上的表達呈負相關，而根據分組比較得到妊娠組Cx37的表達低于非妊娠組，提示排卵前Cx37表達下降預示著卵母細胞相對成熟。本研究結果說明Cx37作為預測MⅡ卵的發生、以期預測卵泡成熟率有一定的意義。hCG日孕酮及雌二醇均與Cx37的表達呈正相關，但因二者指標同時與卵泡發育個數有關，暫無法明確Cx37是否可預測孕酮及雌二醇的表達量。同時根據移植術后14天測定的hCG值將患者分組為妊娠組及非妊娠組，發現Cx37的含量與孕酮及雌二醇無統計學意義。目前尚缺乏對于顆粒細胞上Cx37表達的研究，本研究采用流式細胞術，現臨床多用于白血病診斷及分類，但其快速、僅需少量樣本即可檢測等特點應多加應用，尤其在不孕不育患者中，部分患者取卵量少，增加評估質量的難度，這些通過流式細胞術均可彌補。

綜上所述，通過對卵泡液中顆粒細胞膜表面間隙連接蛋白37的檢測，發現其表達與MⅡ卵率、IVF-ET后生化妊娠存在相關性，流式細胞術定量測定Cx37用于臨床，可對卵泡成熟作出快速診斷，并以期預測妊娠率。