一種用于內耳siRNA轉染的新型蛋白載體

亓衛東 丁大連 曹軼倓 袁芳

1復旦大學附屬華山醫院耳鼻咽喉頭頸外科 上海200040 2美國紐約州立大學布法羅分校耳聾及聽力研究中心 NY 14214 USA

RNA干擾（RNAi）作為一種轉錄后階段的基因沉默工具，可起到高度特異性的基因敲除效果，與傳統的基因敲除及反義技術相比具有高效、特異、低毒、周期短、操作簡單等優勢。RNAi在內耳的應用取決于能否保證siRNA高效轉染以及載體的低毒性。我們構建了一種小干擾RNA（siRNA）蛋白轉導載體細胞穿透肽-雙鏈RNA結合域重組融合蛋白（TAT-DRBD）。通過活體動物實驗已經證實，這種載體可在24小時內成功攜帶Cy3標記的siRNA進入耳蝸內毛細胞和外毛細胞、螺旋神經節細胞、血管紋上皮細胞、橢圓囊斑和球囊斑及壺腹嵴的毛細胞和支持細胞，其經圓窗膜徑路的轉染效率達到100%[1]。在本研究中，我們在內耳器官離體條件下進一步驗證TAT-DRBD載體的轉染效率及安全性，并與經典脂質體載體LipoFiterTM的安全性進行了比較。我們建立了卡鉑南美栗鼠的內耳損害動物模型，并在活體南美栗鼠應用RNAi特異性下調Slc31a1基因的表達，以進一步證明通過對銅轉運輸入通道的暫時特異性阻斷是否可以有效阻止鉑制劑進入靶細胞，從而實現對毛細胞的保護。

圖1 DNA重組TAT-DRBD載體標準化構建流程Fig.1 Standardized process to construct TAT-DRBD vector by DNA recombination technology

1 材料和方法

1.1 TAT-DRBD載體的構建

細胞穿透肽-雙鏈RNA結合域重組融合蛋白（TAT-DRBD）由上海近岸蛋白質生物有限公司完成構建。標準化構建流程及氨基酸序列見圖1，圖2。質控標準，蛋白純度：SDS-PAGE＞95%，經檢測內毒素＜1EU/mg，宿主DNA殘留＜10ng/劑量，宿主蛋白質殘留＜0.1%。……