基于尿蛋白組學(xué)的CKD273在慢性腎臟病中的應(yīng)用進(jìn)展

徐耀　徐艷　劉昌華

【摘要】 目前，慢性腎臟病的診斷及預(yù)后缺乏準(zhǔn)確性、敏感性，主要是受到特異性生物標(biāo)志物的限制。早發(fā)現(xiàn)及預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生，以提高生存率和生活質(zhì)量為目標(biāo)極為關(guān)鍵。尿液是探索腎臟疾病生物標(biāo)志物的寶貴資源，近年來由于組學(xué)平臺和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，產(chǎn)生了許多關(guān)于腎纖維化的新型生物標(biāo)志物的研究。基于尿蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物的分類器CKD273與腎臟疾病和腎纖維化的嚴(yán)重程度有關(guān)，并已證明其在預(yù)測DKD及心血管事件的重大價值。CKD273具有腎臟病精準(zhǔn)化治療的里程碑意義，基于這個成功的例子，蛋白質(zhì)組學(xué)有望發(fā)展成為指導(dǎo)精準(zhǔn)化干預(yù)的關(guān)鍵技術(shù)。筆者回顧了過去10年尿蛋白質(zhì)組學(xué)的重大發(fā)展，重點(diǎn)介紹了CKD273模型在慢性腎臟病中的應(yīng)用進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 尿蛋白組學(xué) CKD273 慢性腎臟病 糖尿病腎病

Progress in the Application of CKD273 Based on Urine Proteomics in Chronic Kidney Disease/XU Yao， XU Yan， LIU Changhua. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： -169

[Abstract] At present， the diagnosis and prognosis of chronic kidney disease lacks accuracy and sensitivity， mainly due to the limitation of specific biomarkers. Early detection and prevention of complications are critical to improving survival and quality of life. Urine is a valuable resource for exploring biomarkers of kidney disease. In recent years， due to the rapid development of omics platforms and bioinformatics， many new biomarkers of renal fibrosis have been produced. The CKD273 classifier based on urine proteome biomarkers is related to the severity of kidney disease and renal fibrosis， and has proven to be of great value in predicting DKD and cardiovascular events. CKD273 is a milestone in the precise treatment of kidney disease. Based on this successful example， proteomics is expected to develop into a key technology to guide precise intervention. We reviewed the major developments in urinary proteomics over the past 10 years， highlighting the application of CKD273 in chronic kidney disease.

[Key words] Urine proteomics CKD273 Chronic kidney disease Diabetic kidney disease

First-authors address： Jiangsu Province Subei Peoples Hospital， Clinical Medicine College， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.043

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一個日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，影響全世界約17%的成年人口，65歲以上者患病率更高達(dá)20%[1]。CKD最終導(dǎo)致終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD），糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致CKD的最常見原因，并且與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)。許多大規(guī)模臨床研究表明，通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）系統(tǒng)可以保護(hù)腎功能、延緩腎臟病進(jìn)展[2]，因此早期診斷CKD、延緩ESRD發(fā)生是目前研究的重點(diǎn)。目前，DKD早期診斷及進(jìn)展評估主要基于微量白蛋白尿和腎小球?yàn)V過率估計值（estimated glomerular filtration rate，eGFR）的評估。然而，這些參數(shù)缺乏敏感性和特異性。首先，臨床上一部分糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者發(fā)生腎功能損害而沒有明顯的白蛋白尿，其次DKD患者發(fā)病初期腎臟呈高濾過狀態(tài)，當(dāng)疾病進(jìn)展并且50%的腎功能已經(jīng)喪失時，eGFR才出現(xiàn)顯著降低，其是疾病進(jìn)展的晚期征兆。目前，基于尿蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展及CKD273分類器的不斷完善為DKD的早期診斷和風(fēng)險評估提供了新思路。

1 尿蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展進(jìn)程

蛋白質(zhì)是生命機(jī)制的功能執(zhí)行者，它們已被用作許多疾病的預(yù)后生物標(biāo)志物，如DKD、心血管疾病和癌癥。蛋白質(zhì)組是指由生物體表達(dá)的全套蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)是對蛋白質(zhì)組的研究。蛋白質(zhì)作為遺傳信息（包括環(huán)境影響）的表達(dá)結(jié)果，其水平的變化提供了有關(guān)特定疾病改變途徑的信息，因此，蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來描述生物體或器官的功能狀態(tài)，并為進(jìn)一步研究疾病的分子機(jī)制提供途徑。蛋白組學(xué)可用各種不同的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行研究，如二維凝膠電泳，毛細(xì)管電泳耦合電噴霧電離-質(zhì)譜（CE-ESI-MS），液相色譜-耦合質(zhì)譜（LC-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（MALDI-MS）[3]。隨著蛋白質(zhì)分離技術(shù)和質(zhì)譜的發(fā)展，基于CE-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于臨床樣品的分析，可用于識別組織、細(xì)胞、體液中蛋白質(zhì)的變化，其具有高敏感性、高特異性和高通量等特性，能提供一般方法無法提供的有價值的疾病信息。CE-MS已被證明是一種可運(yùn)用于臨床的成熟蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，其是迄今為止提供最多可比較蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的平臺，目前有超過40 000例人尿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集可供使用[4]，可實(shí)現(xiàn)基于>10 000個受試者的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。蛋白質(zhì)組學(xué)涉及生物樣品中蛋白質(zhì)和多肽的大規(guī)模分離和定量，由于可同時測量多種潛在疾病的致病途徑，是早期識別DKD的有前景的技術(shù)。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)確定了幾種與慢性腎衰有關(guān)的尿生物標(biāo)志物，如α-1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT），細(xì)胞外谷胱甘肽過氧化物酶和載脂蛋白A-1[5]。

尿液是一種有價值的生物流體，正常生理條件下尿液應(yīng)僅含有少量低/中分子量蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)含量在病理情況下發(fā)生變化。尿液一直是生物樣本的首選，它經(jīng)過腎臟濾過、重吸收，含有穩(wěn)定的肽，無須進(jìn)一步處理即可進(jìn)行質(zhì)譜分析，因此是用于CKD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究首選的生物樣本。目前綜合運(yùn)用組學(xué)檢測技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)以及大數(shù)據(jù)信息平臺技術(shù)的CE-MS技術(shù)是用毛細(xì)管電泳（CE）分離肽，然后通過質(zhì)譜（MS）鑒定，結(jié)果存儲在適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫中，隨后評估存儲在數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)組譜和臨床數(shù)據(jù)，以建立和驗(yàn)證用于相關(guān)臨床目的生物標(biāo)志物，而這正是目前腎臟疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的趨勢。尿蛋白質(zhì)組學(xué)在尋找新的早期預(yù)測CKD及診斷的特異標(biāo)志物中顯示出極大的臨床應(yīng)用潛力。

2 CKD273在CKD中的應(yīng)用

基于以上技術(shù)的發(fā)展，在2010年Good等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，CKD組尿液中有273種肽存在差異表達(dá)，隨后其使用向量機(jī)將這273種肽組合成一種叫作CKD273的分類器，并描繪了曲線下面積（AUC）為0.96，至此，CKD273成功地將CKD患者與健康人區(qū)分開來。CKD273分類器由尿中273種差異調(diào)節(jié)尿肽組成，包括不同的膠原蛋白片段、腎特異性蛋白（鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶γ鏈，膜相關(guān)孕酮受體成分1等）、血液衍生蛋白片段（例如纖維蛋白原，載脂蛋白，血紅蛋白α鏈，纖維蛋白原α鏈等），其中主要是1型和3型膠原蛋白片段，但對應(yīng)于源蛋白的肽如白蛋白，尿調(diào)節(jié)素和A1AT也在其中，因此可以同時反映多種疾病的致病途徑[6]。

此外，Genovese等[7]通過研究表明，CKD273中各種膠原蛋白片段的修飾可能表明細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的變化，這是CKD早期腎臟損害的標(biāo)志，且在腎組織纖維化期間，腎間質(zhì)中瘢痕組織的形成是ECM過度增生的結(jié)果。Magalh?es等[8]檢測了42個腎活檢組織的纖維化程度和對應(yīng)樣本的尿蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)7種纖維化相關(guān)肽與纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，CKD273和特異性肽與腎纖維化顯著相關(guān)。

由于目前臨床上導(dǎo)致CKD的病因各不相同，疾病存在隱匿且發(fā)展速度不一的特點(diǎn)，基于eGFR或尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）標(biāo)準(zhǔn)無法準(zhǔn)確預(yù)測CKD進(jìn)展，由于缺乏早期識別CKD進(jìn)展的工具以及對有效的干預(yù)措施，導(dǎo)致CKD已成為全球增長最快的死因之一。CKD患者的尿液排泄中包含豐富的血漿蛋白片段（人血白蛋白和纖維蛋白原），這可能反映了腎小球?yàn)V過屏障的慢性損害。一項在涵蓋CKD所有階段的研究中評估了CKD273分類器的診斷和預(yù)后價值，CKD273分類器在早期腎病[eGFR大于60 mL/（min·1.73 m2]的評估中表現(xiàn)優(yōu)于UAER和UAER/eGFR （AUCCKD273=0.93 vs AUCUAER=0.67，AUCCKD273=0.94 vs AUCUAE/eGFR=0.91）[9]。而關(guān)

于CKD273中對于疾病進(jìn)展性的預(yù)測，一項納入了2 672例不同CKD分期患者的橫斷面研究顯示，在疾病早期階段，進(jìn)展者eGFR下降>5 mL/（min·1.73 m2）較非進(jìn)展者膠原蛋白和尿調(diào)節(jié)素片段減少;在中晚期eGFR 40～60 mL/（min·1.73 m2）進(jìn)展者A1AT和人血白蛋白片段增加，而與晚期CKD eGFR<40 mL/（min·1.73m2）相關(guān)的尿肽顯示出高度可變的分布，顯示出CKD273分類器在預(yù)測CKD患者的腎功能方面表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性[10]。此外，CKD273的預(yù)后準(zhǔn)確性也超過了單個生物標(biāo)志物，可能是與肽的生物學(xué)變異性有關(guān)[6]。

關(guān)于CKD273在臨床運(yùn)用的證據(jù)等級，Critselis等[11]綜合分析了目前已經(jīng)報道的四項前瞻性隊列研究，指出CKD273可預(yù)測微量或大量白蛋白尿的發(fā)展和eGFR的快速下降（每年下降速度>5%），根據(jù)牛津循證醫(yī)學(xué)（Oxford Evidence-Based Medicine，EBM）和推薦分類法（Strength of Recommendation Taxonomy，SORT）指南證據(jù)等級分別被歸為1b級和1～4分，且分類器的效能與年齡、性別和所用尿液儲存容器的類型無關(guān)。

Argilés等[12]對76例不同程度的CKD患者進(jìn)行了尿蛋白質(zhì)組的檢測并進(jìn)行了長達(dá)6年的隨訪發(fā)現(xiàn)，CKD273是第一個在獨(dú)立隊列研究中成功預(yù)測CKD進(jìn)展預(yù)后的蛋白質(zhì)組學(xué)分類器。隨后，文獻(xiàn)[13]將研究對象擴(kuò)大到一般人群，評估了CKD273與腎功能相關(guān)的橫斷面和縱向關(guān)聯(lián)，并且前瞻性地研究與心血管并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)，認(rèn)為CKD273在預(yù)測早期CKDeGFR>70 mL/（min·1.73 m2）進(jìn)展的價值較高，在疾病晚期中效能降低。

鑒于膠原片段的改變是腎臟和心血管疾病進(jìn)展的關(guān)鍵，1型和3型膠原在血管中比腎小球基底膜改變更加明顯，CKD273可能不僅僅是CKD的標(biāo)志物，也是心血管疾病的非特異性標(biāo)志物。有報道稱，尿蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記物可在傳統(tǒng)危險因素不明顯的人群中識別出發(fā)生CVD或死亡的高風(fēng)險患者，并且為平均風(fēng)險較低的人群提供更準(zhǔn)確的風(fēng)險預(yù)測，從而可以為臨床決策提供依據(jù)[14]。

3 CKD273在DKD中的應(yīng)用

DKD是慢性腎臟病的主要病因之一，其發(fā)展特征是尿白蛋白排泄率從無蛋白尿到微量蛋白尿再到大量蛋白尿。微量白蛋白尿（30～300 mg/24 h）被認(rèn)為是目前預(yù)測DKD發(fā)展的最佳指標(biāo)，然而由于個體的差異性，其在臨床上的準(zhǔn)確性受到很大影響。有報道稱，近半數(shù)的Ⅰ型糖尿病患者并未檢測出明顯的白蛋白尿，然而腎功能已受到嚴(yán)重?fù)p害，這表明白蛋白尿缺乏敏感性[15]。目前，CKD273分類器已被證實(shí)與正常白蛋白尿患者進(jìn)展為微量白蛋白尿（microalbuminuria，MA）有關(guān)[16]，早期識別可能進(jìn)展為微量白蛋白尿的個體對DKD的早期治療有重要意義。已有研究表明，包括膠原蛋白片段、α-微球蛋白、β2-微球蛋白、A1AT、尿調(diào)節(jié)素等尿肽是一種有前途的生物標(biāo)志物組，可用于早期檢測T2DM患者發(fā)展至DKD階段[16]。基于尿膠原片段與腎功能相關(guān)的多個觀察結(jié)果，有學(xué)者認(rèn)為在CKD尤其是在DKD中，生理性膠原蛋白降解減弱，這導(dǎo)致ECM中的膠原蛋白增加和纖維化，使得CKD273能夠檢測具有進(jìn)展至DKD的風(fēng)險的糖尿病患者，而與尿白蛋白濃度無關(guān)[17]，其為早期診斷非蛋白尿糖尿病腎病（normoalbuminuric diabetic kidney disease，NADKD）帶來了新希望[18]。

最近的橫斷面研究檢測了155例2型糖尿病患者的MA并用CE-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析以測定CKD273分類器評分，并以全因死亡率作為終點(diǎn)進(jìn)行6年的隨訪，結(jié)果顯示在Cox回歸模型中UAER（β=0.402，P<0.001）和eGFR（β=-0.184，P=0.039）是CKD273的決定因素[19]，而UAER和eGFR已被證實(shí)是DKD和一般人群心血管事件和死亡率的獨(dú)立預(yù)測因子[20]。除了預(yù)后價值外，有研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦在DKD中治療兩年后CKD273評分發(fā)生顯著改變且與健康人相近[21]。此外，在一項名為PRIORITY的國際多中心臨床試驗(yàn)和觀察性研究中，該分類器被證明可用于監(jiān)測DKD患者管理并進(jìn)行危險程度分層，此外，該實(shí)驗(yàn)還闡明了早期檢測糖尿病腎病與螺內(nèi)酯治療相結(jié)合的潛在益處[22]。另外，在早期檢測DKD進(jìn)行特異性治療的效用目前正在進(jìn)行多中心的前瞻性試驗(yàn)[23]。

4 其他腎臟病中的應(yīng)用

尿蛋白質(zhì)組學(xué)同樣也應(yīng)用于其他腎臟病領(lǐng)域，例如狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）或常染色體顯性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）。血管緊張素Ⅱ-調(diào)節(jié)蛋白在離體腎組織被發(fā)現(xiàn)，并且在體內(nèi)的動物腎臟模型中得到驗(yàn)證。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，相比于與非ADPKD腎臟病，其在ADPKD患者中的尿排泄率較低，考慮可能與囊腫導(dǎo)致的腎小管損傷有關(guān)[24]。在一項包含88例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者的病例對照研究中，尿α-1抗胰凝乳蛋白酶，視黃醇結(jié)合蛋白和觸珠蛋白被鑒定為LN活動的潛在生物標(biāo)志物[25]。

5 展望

綜上所述，目前初步研究已證實(shí)了尿蛋白質(zhì)組學(xué)以及CKD273分類器在CKD早期診斷及預(yù)后方面的巨大潛力，考慮到尿液標(biāo)本收集的非侵入性和尿蛋白質(zhì)組的相對穩(wěn)定性，CKD273目前正在進(jìn)行大規(guī)模的臨床試驗(yàn)以評估其診斷效能，并通過了美國食品和藥物管理局（FDA）的認(rèn)可[26]，但需要更多大樣本多中心臨床試驗(yàn)來證明其臨床效能。我們下一步努力的方向是在生物標(biāo)志物組中單獨(dú)或組合地研究所提出的肽，并且可能添加目前未發(fā)現(xiàn)的新肽，以找到標(biāo)記CKD診斷、預(yù)后潛力最大價值的組合。另外，想要尿蛋白組學(xué)進(jìn)一步運(yùn)用于臨床，將精準(zhǔn)的科研，實(shí)驗(yàn)室和軟件開發(fā)實(shí)踐于CKD273的質(zhì)量控制和驗(yàn)證是必不可少的。

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（收稿日期：2019-12-24） （本文編輯：周亞杰）