新冠肺炎病毒SARS-CoV-2國內檢測方法匯總

武英，周洪彬，張玨，高莉，李文赟，吳虹麗，吳小林

(成都大學，四川抗菌素工業研究所，抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，成都 610052)

新型冠狀肺炎病毒SARS-CoV-2的檢測方法主要有全基因組測序、核酸檢測法和免疫學檢測法。由于對整個基因組測序對實驗條件、設施、人員要求高，檢測時間長，不能滿足快速篩查需要。核酸檢測和免疫學檢測方法是目前普遍采用的方法。我國《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[1]明確指出SARS-CoV-2確診需具有以下病原學證據之一：(1)新型冠狀病毒核酸RT-PCR檢測陽性；(2)病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。RT-PCR檢測只需要檢測病毒的特異性基因，不用對整個基因組測序，大大提高了核酸檢測的效率。為了進一步增加新冠肺炎確診的準確性和效率，國家衛生健康委員會發布的最新版《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》將免疫學檢測法與核酸檢測、病毒基因測序列一起列為疑似病例確診的病原學證據之一[2]。免疫學檢測法是檢測人體免疫系統防御新冠肺炎病毒產生的特異性抗體，包括膠體金法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和化學發光免疫分析(CLIA)、量子熒光免疫層析法技術。

本文綜述了目前國家食品藥品監督管理局(NMPA)審批通過的SARS-CoV-2 檢測試劑盒的技術方法，分析了其優勢和限制，并對新型的病毒檢測技術做出了展望。

1 我國批準的檢測試劑盒種類

截止2020年6月，我國食品藥品監督管理局審核批準生產的新冠肺炎病毒SARS-CoV-2檢測試劑盒有43種，20種是核酸檢測試劑盒，其中22種是免疫學檢測試劑盒，1種是全基因組測序試劑盒，需要配合基因組測序系統使用(見表1)。

核酸檢測法是對病毒RNA 基因組進行檢測，主要分為全基因測序和特異性基因檢測。由于全基因組測序不適用于臨床快速檢測的要求，所以目前新冠肺炎病毒核酸檢測手段主要以檢測特異性基因為主，主要檢測手段有：熒光定量PCR法、微RNA捕獲探針法、雜交捕獲免疫熒光法、雙擴增法、RNA恒溫擴增-金探針層析法和恒溫擴增-實時熒光法等技術。免疫學檢測試劑盒的檢測目標物主要是新型冠狀病毒(2019-nCoV)IgM、IgG抗體以及N-蛋白。檢測方法為膠體金法、酶聯免疫法、上轉發光免疫層析法、量子點熒光免疫層析、化學發光法、直接化學發光法和磁微粒化學發光法。

2 核酸檢測方法

2.1 檢測目標基因

SARS-CoV-2基因組測序解析工作已經完成[3-4]，其基因組含有約29 000 個堿基，12個蛋白編碼區/開放讀碼框(ORF)。其中ORF 1ab 區域的RNA 聚合酶基因(RdRp)編碼的RNA 聚合酶，是病毒RNA復制所必需的核心蛋白[3]。E 區編碼囊膜蛋白，形成病毒包膜及病毒顆粒。N 區編碼核殼蛋白，識別宿主RNA。

由于SARS-CoV-2的RdRp 基因在進化樹上與SARS病毒(SARS-CoV-3)的RdRp 基因顯著不同，因此被定義為一種新的β屬冠狀病毒，而且其所在開放閱讀框ORF 1ab 區域變異性相對較小[5]，因此 RdRp 基因所在區域ORF 1ab 也成為鑒定SARSCoV-2核酸的一個重要標志物。此外，檢測E蛋白基因和N蛋白基因序列也是確認SARS-CoV-2是否存在的重要依據[6]。

表1 國內已取得生產批號的試劑盒

2.2 我國核酸檢測試劑盒的主要方法

2.2.1 熒光PCR法

目前我國最常用的是實時熒光逆轉錄PCR 法(RT-PCR)，20種檢測試劑盒中15種是采用熒光PCR法。檢測目標基因是ORF 1ab基因、囊膜蛋白E基因和核殼蛋白N基因。由于 RNA 病毒容易發生變異，為有效地避免假陽性和假陰性，目前SARS-CoV-2 的PCR 檢測一般會同時檢測 ORF1ab 基因和N 基因，有時還 會在增加檢測E基因。

我國批準生產的試劑盒中僅檢測ORF 1ab基因的試劑盒有2種，檢測ORF 1ab和N基因的有9種，能夠檢測ORF1ab和N基因、E基因三個基因的有4種。

實時熒光PCR法，速度較快、成本相對較低。是我國目前SARS-CoV-2檢測試劑盒中常用的檢測方法。第一步需要進行逆轉錄反應(RT)，然后進行PCR擴增。商品化試劑盒通常把RT反應液與PCR 反應液預混在一起，在密閉環境中一步完成逆轉錄與擴增檢測。操作簡便，且明顯降低開蓋導致的外源性污染的風險[7]。

此技術的核心是設計出靈敏度好、特異性強的PCR 引物和熒光探針。理想的引物和熒光探針不僅能高效地擴增出SARS-CoV-2 基因組的片段，降低假陰性率，又能有效區分SARS-CoV-2 基因組和其他常見冠狀病毒及流感病毒的基因組，降低假陽性率[8]。

郭元元等人[9]對6 家公司的核酸檢測試劑盒的檢測性能進行了比較。發現只有2 種試劑盒能夠同時擴增出ORF1ab 基因和N 基因，其余4 種試劑盒只能擴增出其中一個基因。此外，不同試劑盒同一批次內檢測的重復性也不一致。隨患者病情發展，只有3種試劑盒能檢測出病毒基因拷貝數呈現增加的趨勢。表明不同廠家的檢測試劑盒在靈敏度、穩定性等方面還有進一步提高。

2.2.2 恒溫擴增-實時熒光法(RT-LAMP)

逆轉錄環介導恒溫實時擴增法(RT-LAMP)是2000年由日本研究人員NOTOMI T 等[10]發明的一種新型的體外恒溫擴增特異核酸片段的技術。其技術優勢在于整個反應過程只需要在恒溫環境下進行，避免因變溫熱循環而延長檢測時間。反應結束后可根據擴增副產物焦磷酸鎂沉淀形成的濁度或者熒光染料判斷擴增情況。Yang[11]等人的團隊開發的 RTLAMP法可同時檢測 SARS-CoV-2 的 ORF1ab 基因、E基因和 N 基因，所檢測的 208 個臨床標本的特異性為 99%。Yu[12]等人將這種恒溫擴增-實時熒光法用于檢測SARS-CoV-2 的 ORF1ab 基因發現其檢測下限最低可達10個拷貝，樣品反應時間也比RT-PCR快，且不需要復雜的檢測儀器。Yang[13]等人的實驗也證明RT-LAMP的擴增效率優于RT-PCR只需一個在60～65℃恒溫條件進行擴增，通常在 1 h 內即可完成病毒核酸的檢測。具有靈敏度高，反應迅速等優點。由于其不需要昂貴的設備，可在短時間內快速獲得結果。所以適用于入境口岸的快速篩查工作。

2.2.3 RNA捕獲探針法

RNA捕獲探針法利用特異性靶標捕獲技術(磁珠法)快速捕獲靶標基因片段，然后再結合高分辨分子信標檢測技術，能夠提高病毒的檢測靈敏度和特異性。這種特異性靶標捕獲技術是將磁珠微粒表面標記一段多聚胸腺嘧啶寡核苷酸(Oligo,dT)，與一段帶有Oligo(dA)的特異性的核酸捕獲片段配對結合。當帶有Oligo(dA)的捕獲探針與靶標核酸結合后，用磁鐵吸附磁珠，即可將靶標核酸特異性的提取出來。而且樣本RNA可以常溫保存，全流程標準化操作，排除人為偏差，可以實現高通量檢測，全程僅需90分鐘[14]。

3 免疫學檢測方法

2020年3月4日國家衛健委發布《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》提出新增SARS-CoV-2血清抗體檢測作為輔助檢測手段，指明特異性IgM和IgG陽性、IgG由陰性轉為陽性或恢復期較急性期有4倍及以上升高可作為SARS-CoV-2確診感染的血清學證據[15]。進一步指出抗體檢測不僅需要定量，且在患者治療過程中以及康復診斷出院時均需要檢測。

免疫學檢測方法作為SARS-CoV-2快速確診的輔助檢測手段，不僅能夠降低假陰性的概率，還可降低醫務人員在呼吸道標本采集過程中的暴露風險。目前已在全國廣泛地推廣和應用。

我國通過審批的抗體檢測試劑盒生產廠家有22家，主要檢測方法為膠體金免疫層析法、酶聯免疫法、磁微粒化學發光法、上轉發光免疫層析法、量子點熒光免疫層析、化學發光法、直接化學發光法和等。前三種方法是我國采用的主要檢測方法。

3.1 膠體金免疫層析法(GICA法)

膠體金法檢測抗體的原理是基于抗原抗體的特異性結合和顯色原理。將特異性抗原與膠體金結合并固定在結合墊上，當檢測樣品中有目標抗體出現時，抗體與試劑盒中的金標抗原結合，產生抗原抗體復合物，劑盒中的特異性抗體會捕獲這種帶有顯色標志的抗原抗體復合物，檢測樣品呈陽性。若待測樣品中不含目標抗體，則不顯色，檢測樣品呈陰性[16]。該技術現已發展成為診斷試紙條的形式，檢測樣品可采用靜脈全血、血清或血漿樣品，將樣品與稀釋劑混合，10～15 min后可通過測試條上測試線與對照線的顏色來判斷結果[17]，快速又便捷。

張穩健等[18]測試了膠體金免疫層析法(GICA法)在新型冠狀病毒肺炎診斷中的應用價值。結果表明，在105例SARS-CoV-2 核酸檢測陽性病例中，膠體金法檢測IgM和IgG 抗體的敏感性分別為76.2%和86.6%，IgM/IgG 抗體陽性總體符合率為96.1%。表明該方法具有較好的敏感性及特異性，可用于臨床輔助診斷和流行病學調查。并且標本采集易標準化，檢測時間短。但是該方法會受到血清中類風濕因子(RF)的干擾[19]，從而導致假陽性的出現。

3.2 磁微粒化學發光法

目前國家食品藥品監督管理局(NMPA)通過審批的22個抗體檢測試劑盒中有7個是采用了磁微粒化學發光免疫技術。該技術主要是利用磁微粒作為載體，通過增加表面積和加入外磁場，來提高高靈敏度和檢測速度[17]。趙宗瑞等人[20]用CLSI(美國臨床實驗室標準化協會)EP12-A2和EP15-A2文件兩種方法評估磁微粒化學發光免疫試劑的精密性。其研究表明全自動磁微粒化學發光法用于檢測呼吸道合胞病毒IgM抗體精密性良好，臨床診斷標準符合率高于與同類ELISA方法試劑，可滿足臨床應用需求。張立娟[21]分別采用磁微粒化學發光法和酶聯免疫吸附法對166例自身免疫病患者血清和50 例健康者血清中抗 PR3抗體、抗 MPO 抗體進行定量檢測，磁微粒化學發光法的批內、批間重復性都優于酶聯免疫吸附法，準確度符合要求。但是由于檢測試劑特殊，盒成本較高，且需要特定的化學發光儀才，因此使用范圍也收到一定的限制。

3.3 化學發光法

化學發光法其技術特點在于采用了氧化劑或酶的發光底物作為化學發光物質，經過氧化反應后，形成一個處于激發態的中間體，會發射光子釋放能量。形成的中間體越多，發射的光子越多，可以通過發光信號測量儀器進行定量檢測[22]。其中，直接化學發光法不同之處在于所用的發光劑在化學結構上有產生發光的特有基團，在發光免疫分析過程中不需要酶的催化作用，直接參與發光反應，可直接標記抗原或抗體。目前常見的直接化學發光標記物主要有吖啶酯類化學發光劑[23]。

化學發光法特異性高、線性范圍寬、速度快，已廣泛應用于呼吸道病原體的檢測[24]。田鵬鵬[25]等人收集了108例SARS-CoV-2患者和23例疑似患者以及其他病例90例，采用化學發光法檢測所有研究對象的SARS-CoV-2 特異性IgM和IgG抗體，核酸RT-PCR檢測結果作為比對。結果表明化學發光法檢測IgM/IgG的敏感性、特異性、準確性、分別為98.1%、89.4%、93.7%，化學發光法檢測聯合RTPCR可以更好地排除或確診，避免疾病漏診。

4 討論

隨著SARS-CoV-2 病毒在全球蔓延，在尚無特效藥物和疫苗的情況下，快速檢測出病毒攜帶者并將之隔離是阻斷病毒傳播最有效的方式。因此迫切需要大量快速、準確的檢測試劑盒。目前，各國科研工作者也緊急開發各種檢測手段，使得檢測技術突飛猛進。麻省理工學院的張鋒教授[26]基于CRISPR 基因編輯技術開發了一種快速高效而且操作簡便的檢測 SARSCoV-2 的新方法，在后續的研究中利用合成的 SARSCoV-2 RNA 片段進行了測試，發現該技術能夠在很低的病毒 RNA 溶度下(10～100 拷貝/μL)準確的檢測到 SARS-CoV-2 RNA 序列，耗時不超過1h[27]。

目前核酸檢測仍然是確診SARS-CoV-2 的金標準，但由于在取樣部位、樣本采集、設備儀器以及試劑盒引物設計等多方面不可控因素的存在，不可避免地會出現“假陰性”問題。加之操作步驟較多、耗時較長，對實驗室人員技術要求較高，在快速篩查大量疑似患者和密切接觸人群時仍有諸多不便。因此抗體檢測作為輔助檢測手段也得到了發展。但是抗體檢測由于受到內源性干擾物(類風濕因子、嗜異性抗體、補體等)和外源性干擾物(標本溶血、被細菌污染、貯存時間過長或凝固不全)等因素的影響，會出現“假陽性”[28]。因此，在診斷SARSCoV-2過程中，建議核酸檢測聯合抗體和影像學檢測綜合判斷，以做出最終診斷意見。