CCL5/CCR5基因啟動子多態性與糖尿病性微血管并發癥的相關性評估

李華君，董艷芳，孔五寶，羅 英，金倩倩，王曉蘊，王元松，孫云川，牛躍龍，趙紅敏

近年來，糖尿病的患病率迅速增加[1-3]。糖尿病性微血管并發癥(DMI)，例如糖尿病腎病(DN)和糖尿病視網膜病變(DR)，是最具破壞性的糖尿病臨床表現[4-6]。DMI的危險因素包括高血糖、高血壓和遺傳因素。盡管降血糖和降高血壓治療是一種有效的方法，但許多患者最終還是會發生DMI，甚至是在血糖和血壓達到正常水平的情況下[7-8]。所以，上述患者可能存在與DMI相關的遺傳危險因素。此外，DMI被認為是與細胞因子相關的先天性免疫反應，而特定細胞因子的下調可以降低DMI的發生率。識別具有較高風險的細胞因子將有助于DMI的早期預防護理。趨化因子配體5(CCL5)是C-C趨化因子家族的成員，主要在CD8+ T細胞表達[9-10]。CCL5具有募集、激活和刺激T細胞的能力，從而介導先天性和適應性免疫反應[11]。CCL5的同源受體，趨化因子受體5(CCR5)是G偶聯7次跨膜趨化因子受體，是β型趨化因子受體家族的成員，主要表達于T細胞和巨噬細胞[12-13]。CCR5的遺傳失活與單核細胞/巨噬細胞進入受損血管的減少有關，這是DMI發病機理中最早的事件。此外，相關研究已經表明，CCL5/CCR5表達在DN或DR患者中增加，并且其異常表達與腎損傷或眼內新生血管形成有關[14-15]。因此，CCL5或CCR5基因的突變可能是DMI的致病因素。篩選CCL5/CCR5基因的序列變異可以鑒定出幾種遺傳變異體。最常見的多態性是CCL5-403 G/A(G到A改變)，CCL5-28 C/G(C到G改變)和CCR5-59029 G/A(G到A改變)。但是，有關CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G、CCR5-59029 G/A和DMI風險的研究存在爭議[16]。一些研究表明，CCL5和CCR5基因變異可能是DMI的易感因素[17]。然而，該結果沒有被其他研究證實。本研究的主要目的是對CCL5/CCR5基因變異與DMI風險之間的關聯進行更精確的評估。次要結果是確定可能影響CCL5/CCR5基因多態性與DMI風險之間關聯強度的因素。

1 資料及方法

1.1研究資料 搜索PubMed、Embase、Medline、中國國家知識基礎設施、Web of Science、Cochrane數據庫以及相關研究的參考文獻清單。將術語“CCR5”“CCL5”和“RANTES”與“糖尿病”或“DMI”或“DN”或“糖尿病腎病”或“DR”或“糖尿病視網膜病變”或“變異”或“突變”或“多態性”進行檢索。對語言或文章是否已發表沒有限制。本研究還檢查了這些文章的參考文獻，以篩選出其他相關出版物。此外，根據“首選評價和薈萃分析報告”聲明進行了薈萃分析。

1.2研究選擇標準 納入文章符合以下標準：①病例對照研究：以DN和(或)DR患者為病例組，無并發癥糖尿病患者為對照組；②前瞻性隊列研究；③與CCL5-403 G/A，CCL5-28 C/G和CCR5-59029G/A多態性和DMI風險相關的研究。排除標準：①非病例對照研究；②對照組包括非糖尿病患者；③糖尿病患者合并嚴重的其他疾病，例如惡性腫瘤和嚴重的心臟功能障礙。

1.3數據提取 審查研究資格，并提取DMI中遺傳變異的頻率差異。當包含同一作者的一項以上研究時，本研究僅包括最完整的研究。從文章中提取的數據包括作者姓名、文章年份、種族、基因型病例和對照受試者的數量、年齡、性別、糖化血紅蛋白水平和糖尿病亞型。

1.4統計學方法 Hardy-Weinberg平衡由χ2檢測。通過優勢比(OR)和95%置信區間(CI)評估遺傳變異和DMI關聯的強度。如果關聯顯示異質性(I2>25%)，則將隨機效應模型合并。此外，進行敏感性分析以確定異質性的來源，從而評估異質性是否顯著影響結果。通過以下方法分析CCL5/CCR5基因突變與DMI之間的關聯：CCL5-403 G/A(GA+AA vs GG；AA vs GA+GG)，CCL5-28 C/G(GC+CC vs GG；CC vs GC+GG)和CCR5-59029G/A(GA+AA vs GG；AA vs GA+GG)。在這些病例對照組中計算A等位基因(CCL5-403 G/A和CCR5-59029 G/A)和G等位基因(CCL5-28 C/G)的風險頻率。糖尿病的亞型(1型糖尿病或2型糖尿病)，DMI的特定類型(DN或DR)，DN的階段[微量白蛋白尿、大量蛋白尿或終末期腎臟疾病(ESRD)]和種族(高加索人或亞洲人)進行分層分析。Egger的測試和Rosenthal的故障安全編號(Nfs)用于測試發布偏差。P<0.05的值被認為是顯著差異。對于每個元比較，Nfs的顯著性均設置為0.05。如果計算出的Nfs值小于研究次數，則薈萃分析結果可能顯示存在發表偏倚的風險。公式Nfs0.05=(Σ?/1.64)2-(是包括在本研究的物品數量)。所有分析均使用Review Manager 5.2(Cochrane Collaboration，英國牛津)和STATA 10.0(美國德克薩斯州大學城，StataCorp)統計軟件程序。這項薈萃分析是使用Mantel-Haenszel統計方法和樣本量進行比較的加權均數差。

2 結果

2.1研究特征 本研究選取了601篇相關研究的報告，然后對文章進行檢查及篩選。總共招募了2737例DMI患者和2435例糖尿病對照。在這些研究中，9項評估為白蛋白尿，其中3項評估為微量白蛋白尿，5項評估為大量白蛋白尿和1項評估為ESRD。

2.2主要薈萃分析結果

2.2.1CCL5-403G/A、CCL5-28 C/G和DMI的危險因素分析：之所以使用固定效應模型，是因為數據的異質性<30%。結果表明CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G多態性與DMI無顯著相關性(CCL5-403 G/A的OR為1.00；95%CI為0.82，1.21；P=0.98。CCL5-28 C/G的OR為1.02；95%CI為0.79，1.33；P=0.87)。對糖尿病和種族的亞型進行亞組分析發現，單獨排除兩個變量不會對合并的關聯產生顯著變化。見表1。

表1 優勢模型對CCL5多態性和DMI風險的Meta分析

2.2.2CCR5-59029 G/A和DMI的危險因素分析：當將CCR5-59029 GA+AA基因型設置為主要危險因素時，結果表明CCR5-59029 GA+AA基因型與DMI風險增加相關(OR為1.77；95%CI為1.06，2.97；P=0.02)。當將AA基因型設為隱性危險因素時，AA基因型與DMI風險之間沒有顯著相關性(OR為1.28；95%CI為0.75，2.17；P=0.36)。這些結果表明，CCR5 59029A陽性基因型(G/A或A/A)是DMI的獨立危險因素。為了進一步評估DMI(I2=85%)的異質性原因，選擇種族、DMI的特定類型和DN階段進行亞組分析。結果表明，種族和DN階段與異質性相關。在排除高加索人之后，異質性消失(I2=0%)，并且在亞洲人中發現了顯著的關聯(OR為2.08；95%CI為1.68，2.57，P<0.001)。CCR5 59029A陽性基因型顯著增加白蛋白尿的風險(微量白蛋白尿OR為1.68；95%CI為1.15，2.44；P=0.01；大量蛋白尿OR為2.70；95%CI為1.07，6.83；P=0.04)。由于只有1項針對ESRD的試驗，本研究無法探討CCR5 59029A陽性基因型與ESRD風險之間的關系。見表2。

表2 優勢模型對CCR5多態性和DMI風險的Meta分析

2.3出版偏倚 測試了納入研究的所有結果的偏倚。漏斗圖顯示，在這些研究中未發現明顯的出版偏倚。見圖1～3。本研究還計算了CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G和CCR5-59029 G/A的Nfs0.05。每個比較的Nfs0.05值均大于本研究中包括的研究數量。

圖1 CCL5-403 G/A多態性與DMI風險關聯的發表偏倚漏斗圖

圖2 CCL5-28 C/G多態性與DMI風險關聯的發表偏倚漏斗圖

圖3 CCR5-59029 G/A多態性與DMI風險關聯的發表偏倚漏斗圖

3 討論

單核苷酸多態性的遺傳流行病學研究可以探索候選基因與疾病風險之間的關聯[18-19]。在目前的薈萃分析中發現CCL5基因多態性與DMI的風險沒有正相關。但是，CCR5中的59029A多態性可能會影響個體對DMI的易感性，而CCR5 59029A陽性基因型與亞組(分別為“2型糖尿病”或“亞洲人”)中DMI風險增加相關。此外，CCR5 59029A陽性基因型與微量白蛋白尿和大量蛋白尿的風險增加相關。

種族差異可能部分歸因于遺傳和地理環境之間的相互作用。考慮到DMI具有復雜的病因，涉及環境和遺傳因素的綜合影響，因此不同種族的人群具有不同的等位基因頻率和遺傳背景，這可能會影響DMI的風險。在本研究中發現，高加索人群中“A”等位基因的發生頻率(病例組：平均0.0035，范圍0.002～0.006；對照組：平均0.0057，范圍0.002～0.015)低于亞洲人群(病例組：平均0.0123，范圍0.004～0.029；對照組：平均0.0080，范圍0.002～0.011)，這可能是不同種族之間遺傳易感性變化的來源之一。此外，種族可能與治療活動相關，例如藥物使用或血糖目標。Mokubo等[20]發現，亞洲患者中CCR5 59029A陽性基因型和10年平均糖化血紅蛋白值與DMI風險呈正相關。但是，Mlynarski等[21]未能找到與高加索人的這種關聯。因此，治療活動可能是研究不一致的原因。

CCL5基因多態性與DMI的風險沒有顯著相關性。此外，本研究只集中在DMI，并沒有評估CCL5基因多態性與其他疾病，如動脈粥樣硬化、多發性硬化癥和變應性哮喘的相關性。CCL5基因多態性的潛在作用可能被其他基因-基因或基因-環境相互作用所掩蓋。

DMI是由多種遺傳和環境危險因素共同作用引起的。在本研究中發現，在亞洲人中，CCR5 59029A陽性基因型是DMI的重要易感因素，這表明CCR5中的rs1799987基因變異可能會增加亞洲人DMI的風險。因此，在亞洲人群中，CCR5可能為DMI的早期預防性檢測提出了新的目標。

此外，對本研究中納入研究的所有結果進行了出版偏倚測試。通過漏斗圖顯示，在發表的這些研究中未發現明顯的出版偏倚。且本研究還計算了CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G和CCR5-59029 G/A的Nfs0.05。每個比較的Nfs0.05值均大于本研究中包括的研究數量。

本研究具有一些局限性。首先，CCL5多態性的樣本量相對較小，需要進一步的研究以確認結論。其次，本研究僅關注CCL5/CCR5啟動子上的單核苷酸多態性，還應研究CCL5/CCR5基因中的其他單核苷酸多態性以闡明CCL5/CCR5在DMI中的作用。再次，在這項薈萃分析中，大多數高加索人研究涉及1型糖尿病，但不涉及2型糖尿病。CCR5基因多態性與高加索人DMI風險之間缺乏關聯可能部分歸因于糖尿病的類型而非種族。

綜上所述，CCL5基因啟動子多態性與DMI的風險沒有關聯。但是，CCR5 59029A多態性會影響個體對DMI的敏感性。