泰妙菌素高產菌的紫外誘變選育

陳亞蘭 陳德剛 張冰瑩

摘 要：為了進一步提高泰妙菌素的發酵水平，通過單因素試驗確定生產菌T19-127L最佳種瓶培養時間為4d，最佳發酵周期為9d，最佳紫外照射時間為160s;采用紫外誘變技術，篩選到1株突變菌株，遺傳性狀穩定;通過發酵搖瓶驗證，其搖瓶效價為13352u·mL-1，比出發菌株（9605u·mL-1）提高39%，連續傳代實驗結果表明，其具有良好的遺傳穩定性。

關鍵詞：泰妙菌素;紫外誘變;選育;效價

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930016

泰妙菌素（Tiamulin，TML）別稱泰妙靈、支原凈等[1]，是一種常見的半合成的雙萜烯類獸用抗生素[2]。TML是擔子菌側耳屬發酵得到截短側耳素后，再經化學合成方法得到其氫化延胡索酸鹽，TML是首個截短側耳素（Pleuromulin）類的獸用藥物[3]。

目前，為獲得滿足生產需求的目的菌株，常采用自然選育、誘變育種、全局轉錄工程等技術手段來改造菌株[4]。紫外線誘變（Ultraviolet Mutagenesis，UV mutagenesis）是常見的物理誘變方式，廣泛用于微生物菌種的誘變處理，并且有著悠久的歷史[5，6]。紫外線能量低，對核酸造成的傷害比較單一，具有操作簡便、效率高、安全性好、誘變效率高等優點，在避光條件下誘變結束后已產生突變的性狀不易恢復，因此應用較廣泛[7，8]。UNDERT等[9]利用紫外線照射裂褶菌，獲得了3株突變株;MUKHERJEE等[10]利用紫外線處理的草菇原生質體，獲得了4株形態發生突變的菌株和1個營養缺陷型菌株;鄭哲等人利用紫外誘變得到1株較出發菌株產纖維素酶活力提高了40.08%的突變菌株[11]。目前與擔子菌相關的紫外誘變育種的報道較少，本研究為擔子菌誘變育種提供了參考，也為工業生產提供了有效依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

泰妙菌素生產菌（Clitopilus prunulus），菌種號為T19-127L，由寧夏泰瑞制藥集團股份有限公司提供。

1.1.2 培養基

斜面/平板培養基：葡萄糖40g·L-1、胰蛋白胨10g·L-1，瓊脂20g·L-1，pH自然。

種瓶培養基：葡萄糖50g·L-1、酵母提取物20g·L-1、MgSO4·7H2O 0.55g·L-1、FeSO4 0.05g·L-1、Ca（NO3）2 0.5g·L-1，pH 6.2。

發酵培養基：葡萄糖60g·L-1、玉米漿25g·L-1、黃豆餅粉4g·L-1、MgSO4·7H2O 0.4g·L-1、CaCO3 0.9g·L-1、豆油0.6g·L-1，pH 6.7。

1.2 儀器與設備

FA2014N分析天平，北京東南儀誠實驗室設備有限公司;LDZX-50KBS立式高壓滅菌器，上海申安醫療器械廠;HR40-A2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司;MJX-160-Z霉菌培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;FE20 PLUS pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;YT-CJ-2N雙人雙面凈化工作臺，北京亞泰科隆儀器技術有限公司;HZQ-F280全溫振蕩培養箱，太倉市華美生化儀器廠;PSX智能型恒溫恒濕培養箱，寧波萊?？萍加邢薰?。

1.3 試驗方法

1.3.1 T19-127L菌的活化和菌懸液的制備

無菌環境中，取約3cm2的菌絲斜面于研磨器中，加入適量的無菌水，充分研磨，使菌絲斷裂;吸取1mL研磨液于斜面，涂布均勻后，置于27℃培養箱培養。

1.3.2 T19-127L菌生長曲線的測定

無菌環境中，取約3cm2的菌絲斜面于研磨器中，加入適量的無菌水，充分研磨，將其全部轉移至種瓶培養基，27℃、220r·min-1培養。每隔24h取1次樣，稱取10g種瓶培養物于3000r·min-1離心10min，除去上清液，記錄沉淀質量，計算菌濃。用菌濃反應菌體的生長情況，并繪制培養時間—菌濃曲線，菌濃的計算公式：

W=mM×100%（1）

式中，W為菌濃，%;m為沉淀的質量，g;M為種瓶培養物質量，g。

1.3.3 T19-127L發酵周期的測定

無菌環境中，按照10%的接種量將種瓶培養物轉接至發酵瓶，27℃、220r·min-1培養。每隔24h取1次樣，測定發酵液的pH和效價。

1.3.4 紫外誘變實驗

無菌環境中，取約3cm2的菌絲斜面于研磨器中，加入適量的無菌水，充分研磨，制得菌懸液，備用。將菌懸液稀釋1000倍，取0.1mL稀釋液于培養皿，并涂布均勻，置于27℃培養箱中預培養48h后，用紫外燈照射0s、10s、20s、40s、80s、160s、320s、420s（培養皿至紫外燈的垂直距離保持30cm，15W紫外燈），照射結束后繼續于27℃避光培養，防止光復活，平板計數，計算致死率，隨機選取單菌落制成試管斜面保藏，進行效價驗證。致死率的計算公式：

z=xX×100%（2）

式中，z為致死率，%;x為紫外線處理后的單菌落數，個;X為對照組的單菌落數，個。

1.3.5 最適生長pH實驗

將突變株菌懸液稀釋1000倍后，吸取0.1mL稀釋液，分別接種到pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的固體培養基中，并設置3組平行試驗。于27℃恒溫培養，觀察菌落的形成情況。

1.3.6 發酵特性驗證

將出發菌株T19-127L與篩選出的突變菌株按照10%的接種量分別接種到發酵培養基中，并設置3組平行試驗，于27℃，220r·min-1的振蕩培養箱中進行發酵，培養8d后測定發酵液的pH值和效價。

1.3.7 遺傳穩定性試驗

將篩選出的突變菌株進行5次傳代培養，并將每代突變菌株菌懸液按照5%的接種量接種于pH7.5的發酵培養基中，并設置3組平行試驗，27℃、220r·min-1振蕩培養8d后，測定每代突變菌株的產素能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩定遺傳。

1.3.8 檢測方法

pH值，采用pH酸度計對發酵液的pH值進行測定。

截短側耳素高效液相色譜法檢測，配制濃度分別為0.25mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.0625mg · mL-1、0.03125mg · mL-1、0.015625mg · mL-1、0.007813mg · mL-1的截短側耳素標準品甲醇溶液，進行高效液色譜測定，每個濃度重復3次。HPLC液相條件為乙腈：0.02mol·L-1KH2PO4=45：55，UV205nm，流速1mL·min-1，柱溫27℃[12]。

2 結果與討論

2.1 生長曲線

微生物發酵產物的含量與接入發酵瓶的種子的活性有直接關系，通常選擇處于對數生長期的種子進行轉接發酵。通過圖1可知，菌株T19-127L在第2～7天處于對數生長期，分別將培養3d、4d、5d的種子轉接發酵瓶。培養8d后，測截斷側耳素的含量發現，培養4d的種子具有較高的產素能力，因此將種瓶培養時間確定為4d。

2.2 發酵周期

出發菌株T19-127L產素能力與培養時間的關系如圖2所示。效價呈現先增后減的趨勢，培養至第9天效價達到最大;pH則呈現出先增后平的趨勢，同樣培養至第9天發酵液pH出現最大值，發酵第9～11天一直處于7.78左右。因此，將發酵周期確定為9d。

2.3 正向突變菌株的篩選

將預培養物用紫外線處理后，單菌落數隨處理時間的變化情況如圖3所示。隨紫外燈照射時間的增加，培養皿中單菌落數依次減少，而致死率則依次增加。其中，紫外燈照射80～160s時，致死率在50%～80%;紫外燈照射420s時，致死率達97%，說明紫外照射時間對致死率有著重要的影響。通常正向突變一般都出現在70%～80%致死率中[13]，因此實驗選擇的最佳輻照時間為160s，此時菌株致死率為80%，較符合正向突變的理想致死率。隨機挑選14株單菌落制備試管斜面，4℃保藏，備用。

2.4 菌種發酵能力測試結果

分別將14株突變株接種于種瓶培養基中，27℃培養，220r·min-1培養4d后，按照10%的接種量轉接發酵培養基，相同條件下培養9d后用液相色譜法測定發酵液的效價。其中，3株菌種的效價提高了5%～10%;有7株菌種的效價提高了10%～20%;有2株菌種的效價提高了20%～30%，正突變率達到85.7%。

2.5 遺傳穩定性試驗結果

根據生產需求，選擇9號菌株連續培養5代，每代菌株均進行發酵驗證，發酵液的效價如圖4所示。圖4可以直觀反映出突變株的第3代和第4代具有較高的產素能力，但是這5代的產素能力的差異性不顯著（P>0.05），說明突變株在傳代過程中具有穩定的遺傳性。

3 結論

工業生產中，誘變育種是獲得高產菌株常用的方法，都雯玥[14]對Clitopiluspinsitus的原生質體進行重離子輻照誘變，最終選育出C.pin15I5E和C.pin15II6B2株正變異株，其產量較出發菌株分別提高16.17%和15.47%;何海燕[15]等人通過微波誘變獲得果膠酶高產菌株;陳曉麗利用制霉菌素篩選得到截短側耳素高產菌，其效價提高了38.5%。本研究為提高泰妙菌素的發酵水平，采用經典的紫外誘變技術對泰妙菌素生產菌T19-127L進行選育。經紫外誘變，正突變率達到了85.7%，通過大量篩選得到2株菌泰妙菌素突變株，比出發菌株效價提高20%～40%，其中T19-20（13352u·mL-1）的效價最高，比出發菌株T19-127L（9605u·mL-1）提高了39%，且具有良好的遺傳穩定性。

參考文獻

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（責任編輯 ?周康）