不同氨基聚糖對巨噬細胞極化的影響

尹玉，韓碩，王國鋒，王琦，金元哲

（中國醫科大學附屬第四醫院心內科，沈陽 110032）

透明質酸 （hyaluronic acid，HA） 和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS） 是2種不同的氨基聚糖，且已證實均是可靠的細胞移植可降解生物支架材料［1］。巨噬細胞可極化為M1和M2型，研究［2］顯示巨噬細胞對組織的炎癥反應起重要作用。M1型巨噬細胞促進炎癥反應［3-4］，M2型巨噬細胞起抗炎作用［5-6］。白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor，TNF-α） 及誘導性一氧化氮合酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS） 為M1型巨噬細胞特征性細胞因子［3，7-9］；而精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1） 是M2型巨噬細胞特征性細胞因子［3，7，9-11］。本研究通過實時qPCR檢測IL-1β、TNF-α、iNOS、Arg-1mRNA表達，分析HA和CS對巨噬細胞極化的影響，旨在選擇更好的支架材料，減少細胞移植的炎癥反應和炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 HA及CS水凝膠支架材料制成

按照已知方法［1］合成CS-N羥基琥珀酰亞胺 （N hydroxysuccinimide，NHS）及HA-NHS。將HA/CS-NHS加入到磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS） 中制成10%混合液，再將混合液和胎牛血清 （體積比為1 ∶1） 制成HA/CS-血清水凝膠。其中CS-血清水凝膠制成中，先在胎牛血清中加入Bobine血清白蛋白（20 g/dL），然后再與CS混合以促進CS-FBS 水凝膠凝固。

1.2 巨噬細胞提取及培養

1.2.1 骨髓源性巨噬細胞 （bone marrow derived macrophage，BMDM ）提取與分化［12-13］:6～8周齡小鼠分離出股骨和脛骨，用25G針頭和10 mL注射器吸取冷PBS液沖洗骨髓，并用70 μm細胞過濾器除去雜質 （骨質、毛發和其他細胞組織）。在濾過的溶液中加入1×紅細胞裂解液 （10 mL），在37 ℃水浴中培養5 min除去血紅細胞，然后室溫條件下 500g離心5 min，在離心管底部獲得所需細胞，抽吸出上層清液，用BMDM生長液輕輕溶開離心管底部細胞團，放入37 ℃ 5%CO2培養箱中培養 （24孔板，2×105/孔），每3 d更換新鮮BMDM生長液［12-13］，7 d后獲得BMDM。選用未經組織培養處理的細胞培養皿培養BMDM以便于細胞分離和收集。……