利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Fbxw7敲低的Raw264.7穩(wěn)定細(xì)胞株及其生理功能檢測(cè)①

宋璟瑞 周 爽 聞 馨 陳云飛 萬(wàn) 梅 羅梁杰 杜德兵 王德成

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所，宜昌 443002)

Fbxw7(F-box and WD repeat domain containing 7)，是SCF型(Skp1-Cullin-F-box protein)泛素連接酶E3的底物識(shí)別蛋白[1,2]。Fbxw7 能夠通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合底物蛋白，從而使目的蛋白通過(guò)泛素蛋白酶系統(tǒng)降解。大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)bxw7 不僅靶向泛素化降解多種參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白分子，如Notch、Myc、Jun、Cyclin E，還在脂類代謝，細(xì)胞增殖和分化，維持干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[1,3-5]。同時(shí)，最新研究證實(shí)RNA病毒感染過(guò)程中，E3泛素連接酶Fbxw7通過(guò)保持維甲酸誘導(dǎo)Ⅰ型基因(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的穩(wěn)定性，正向調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，最終促進(jìn)機(jī)體抗RNA病毒的天然免疫應(yīng)答[6]。

Fbxw7表達(dá)量的改變會(huì)導(dǎo)致下游底物發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),并在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色[7]。目前關(guān)于Fbxw7參與疾病的發(fā)生與發(fā)展的具體機(jī)制尚不完全清楚[7-9]。但有研究結(jié)果證實(shí)Fbxw7基因敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致發(fā)育缺陷和胚胎致死[10]。所以通過(guò)建立過(guò)表達(dá)或者低表達(dá)Fbxw7的穩(wěn)定細(xì)胞系，可為進(jìn)一步研究Fbxw7的功能與作用機(jī)制提供新的平臺(tái)。本研究利用近年來(lái)在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的成簇的有規(guī)律間隔織的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9) 技術(shù)成功構(gòu)建了Raw264.7巨噬細(xì)胞中Fbxw7基因敲低穩(wěn)定細(xì)胞株,并檢測(cè)Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Raw264.7細(xì)胞中Fbxw7的mRNA和蛋白表達(dá)變化，最后從細(xì)胞增殖、凋亡等方面初步探索Fbxw7在Raw264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)分化中的作用,為深入研究Fbxw7在巨噬細(xì)胞中的功能和機(jī)制提供相應(yīng)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 Raw264.7(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)與293ft(人胚腎細(xì)胞)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。……