氯喹調控視網膜神經節細胞自噬的研究

曾洪波 宋春華 彭 璟 楊秀麗 張曉彧 李爽樂

(自貢市第一人民醫院眼科，自貢 643000)

青光眼是一種神經退行性疾病，其特征是病理性高眼壓和視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)進行性凋亡，是全球不可逆致盲最重要的病因之一[1-3]。有研究表明，RGCs在受損導致的凋亡過程中，其自噬水平會明顯升高。細胞生長過程中基礎水平的自噬可維持細胞內微環境穩態，具有保護細胞的作用[4-6]，但是在多種疾病模型中自噬反而會導致細胞死亡[7,8]。自噬對于細胞凋亡的這種雙重性作用在神經退行性疾病中也存在[9]。氯喹(chloroquine，CQ)是一種抗瘧藥，是常見的抗風濕藥物，也是常見的自噬抑制劑[10]。目前，國內關于CQ與RGCs凋亡之間關系的研究比較少。本研究通過觀察CQ和氯化鈷(CoCl2)作用后RGCs的凋亡與自噬水平的變化，闡明CQ對缺氧誘導的RGCs凋亡的影響，為治療青光眼提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠視網膜神經節細胞RGC-5購于ATCC，用含10%胎牛血清、1%雙抗(美國Gibco公司)DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)于37℃、5% CO2培養箱中培養。CQ購自Sigma公司，抗小鼠LC3B、Caspase-3抗體及二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司，其他試劑購自國藥集團。Loading buffer、RIPA裂解液及細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天公司，Trizol、逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR Mix購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1qPCR RGC-5以5×105個/孔接種于6孔板中，過夜細胞貼壁后，分別加入CoCl2(300 μmol/L)、CQ(30 μmol/L)、CoCl2+CQ處理24 h。使用Trizol法提取細胞總mRNA。分別1 μg mRNA取用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。反應體系為20 μl，其中SYBR Ex Taq 10 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸 20 s，反應40個循環。采用2-ΔΔCt法分析目的基因Beclin1、LC3b、Atg5和Atg7的相對表達量。引物序列見表1。……