siRNA沉默NOK基因抑制腦膠質瘤U251細胞增殖與侵襲①

吳榮強 孫穎盺 張 平 宗 明

(南京醫科大學附屬常州二院檢驗科，常州 213004)

腦膠質細胞瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，其基因治療的瓶頸之一是無法找到關鍵治療靶點。NOK(novel oncogene with kinase-domain)基因是 2004 年從人扁桃體癌中克隆的全新癌基因，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor protein tyrosine kinases，RPTKs)家族成員，與成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)具有20%～30% 的同源性，與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有共同的下游信號通路[1，2]。既往研究證實NOK基因在人腦膠質細胞中高表達，且其表達與腦膠質細胞瘤的惡性程度呈正相關，提示NOK表達對維持腦膠質瘤的惡性生物學特性具有重要作用[3]。但NOK基因如何通過胞外信號進行激活的機制尚未明確。為此，本研究應用siRNA技術干擾NOK基因表達，探討其對膠質瘤細胞U251生長、侵襲及凋亡的影響，闡明NOK基因在腦膠質細胞瘤中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質瘤細胞株U251購自基爾頓生物科技有限公司；DMEM培養基和Opti-MEM培養基購自Gibico公司；胎牛血清購自Hyclon公司；轉染試劑脂質體lipofectamineTM2000和Trizol reagent均購自Invitrogen公司；RNA逆轉錄采用M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega公司；CellTiter96 Aqueous One Solution Reagent (MTS試劑)購自Promega公司；SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒購自TaKaRa公司；AnnexinV-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；NOK antibody (ab97451)、Cyclin D1 antibody (ab16663)購自Abcam公司；Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit (#9916)購自CST公司；siRNA由上海吉瑪公司合成；定量PCR引物由英駿生物技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1siRNA序列設計 NOK siRNA靶序列根據siRNA設計原則及NOK基因的cDNA序列(NM_018423.3)設計，使用Ambion公司在線設計軟件設計針對NOK基因編碼區的干擾核苷酸鏈2對，序列經BLAST同源序列分析后由公司合成。篩選出2組……