miR-194對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移和Wnt/β-catenin信號通路的影響①

宿世瓊 倪 青 侯 凈 王 舒 陳 歡

(貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴陽 550002)

miRNA為非編碼小RNA，長度約19～22 nt，可結(jié)合靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)調(diào)控靶基因表達，為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，在腫瘤形成及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。乳腺癌細(xì)胞中多種miRNA存在異常表達，參與乳腺癌細(xì)胞生長和侵襲遷移[1]。miR-194為miRNA家族成員，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2,3]。Wnt/β-catenin通路參與細(xì)胞分化、增殖，乳腺癌細(xì)胞中存在Wnt/β-catenin通路異常，參與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移[4]。本文對乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-194水平及其對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移和Wnt/β-catenin信號的影響進行研究，探討miR-194對乳腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人正常乳腺Hs578Bst細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，兔抗人GSK-3β單克隆抗體、兔抗人p-GSK-3β單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin-D1單克隆抗體、兔抗人C-Myc單克隆抗體、兔抗人MMP-7單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、RT-PCR試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國BPB公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、MTT試劑、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，miR-194 mimic和陰性對照(上海生工生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞和Hs578Bst細(xì)胞置于RPMI1640(胎牛血清和青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞融合達90%、呈對數(shù)生長時進行傳代。

1.2.2RT-PCR測定miR-194水平 將MCF-7細(xì)胞和Hs578Bst細(xì)胞加入Trizol裂解5 min，提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR測定MCF-7細(xì)胞和Hs578Bst細(xì)胞中miR-194水平，反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共42個循環(huán)。以U6為內(nèi)參。miR-194水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.3MCF-7細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞分為空白對照組(Blank組)、陰性對照組(NC組)和miR-194組。……