成纖維細胞生長因子-21在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達及意義*

李彩霞，周琴，蔣麗華，鄧偉，高玉錄，賈玉芳

（南京中醫藥大學附屬昆山市中醫醫院 1.婦產科，2.病理科，3.檢驗科，江蘇 昆山 215300）

子癇前期為孕婦特發疾病，可影響機體各器官系統。其主要的臨床表現為妊娠20 周后突然出現高血壓和蛋白尿，嚴重時會伴隨全身多臟器功能障礙，如溶血、肝酶升高、血小板減少（即HELLP 綜合征），以及嚴重的中樞神經系統癥狀（即子癇）。其基本病理生理變化是全身小血管痙攣，內皮損傷及局部缺血。全身各系統各臟器灌流減少，對母嬰造成危害，甚至導致母嬰死亡。

子癇前期常表現一些代謝綜合征如肥胖、高血壓、胰島素抵抗、血脂異常等。脂肪細胞能影響母體代謝、胰島素抵抗及炎癥反應，引起糖尿病、代謝綜合征及高血壓。由此，推測脂肪細胞因子可能與子癇前期的發生及病理生理過程密切有關。許多脂肪因子被認為是子癇前期發病的潛在因素，如脂聯素[1]、 Chemerin[2]、瘦素[3]。成纖維細胞生長因子-21（fibroblast growth factor-21, FGF-21）是新型的脂肪細胞因子。關于FGF-21 與子癇前期的研究國內外報道罕見。本文通過對子癇前期孕婦胎盤組織中FGF-21 的檢測，探討FGF-21 在子癇前期孕婦胎盤中的表達及其與臨床生化指標的相關性，從而為子癇前期的發病機制、早期篩查、診斷治療及預防的研究提供新的方向和依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月—2017年12月南京中醫藥大學附屬昆山市中醫醫院孕婦177例作為研究對象。其中，子癇前期組57例，妊娠期高血壓組60例，對照組60例。所有孕婦排除內、外科合并癥及其他產科并發癥。子癇前期、妊娠期高血壓診斷標準參照《婦產科學》第8 版[4]。

1.2 方法

1.2.1 標本收集胎盤娩出后即刻在無菌狀態下于胎盤的母體面（中間避開梗死、出血及鈣化區）取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm 大小胎盤組織3 塊，滅菌生理鹽水充分漂洗后，再用滅菌紗布吸掉水分，其中2 塊分別放入2 個無菌培養皿中，置于-80℃冰箱冷凍保存備用，檢測采用Western blotting 和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。1 塊放入病理標本袋用中性甲醛固定，送病理科包埋做成石蠟包塊用于免疫組織化學研究。

1.2.2 檢測方法免疫組織化學：按照免疫組織化學SP 法檢測試劑盒（上海聯碩生物科技有限公司）說明書操作步驟進行處理。FGF-21 工作濃度1 ∶200。FGF-21 表達以細胞質呈棕黃色為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致為陰性細胞。參照奧茲德米爾（OZDEMIR）方法按切片中陽性物質的含量及表達強度區分：高倍鏡下隨機觀察記數10 個高倍視野、不少于1 500 個細胞中陽性細胞所占百分數，根據陽性細胞數和顯色強度分為：陽性細胞數＜5%或無陽性細胞的表達為陰性；陽性細胞數≥25%或有陽性細胞的表達為陽性；陽性細胞數5%～＜25%或顯色淺為弱陽性。

1.2.3 Western blotting 檢測FGF-21提取胎盤組織中FGF-21 蛋白，按BCA protein Assay Reagent Kit（美國Thermo 公司）說明書操作步驟檢測樣品的蛋白濃度。每泳道上樣20 μg，經PAGE 電泳后轉移至PVDF 膜，先后加入一抗（1 ∶1 000 稀釋），酶標二抗（1 ∶5 000 稀釋），ECL 顯色，化學發光儀顯影拍照。以GAPDH 為內參。

1.2.4 qRT-PCR 檢測FGF-21Trizol-離心柱法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，qRT-PCR 及Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。按照qRT-PCR 常規實驗步驟進行預變性、PCR 反應、熔解、降溫操作。qRTPCR 擴增條件的設置包括擴增曲線：95℃預變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火31 s，共40 個循環；熔解曲線：熔解95℃、15 s，60℃、30 s，95℃、15 s。FGF-21 正向引物：5'-GCCACCTGGTTCAACATC-3'，反向引物：5'-AAGGCTCCCTCCTACTCTG-3'；內參GAPDH 正向引 物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物：5'-A GGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 11.5 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料以例表示，比較用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組孕婦一般臨床及生化指標比較

3 組孕婦體重指數（BMI）、妊娠時間、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、載脂蛋白A1C（ApoA1）、載脂蛋白B（ApoB）、肌酐、尿酸比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。收縮壓、舒張壓、甘油三酯、尿酸，子癇前期組＞妊娠期高血壓組＞對照組；HDL，子癇前期組＜妊娠期高血壓組＜對照組。BMI、膽固醇、LDL、ApoB，子癇前期組和妊娠期高血壓組高于對照組（P＜0.05），子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；ApoA1，子癇前期組和妊娠期高血壓組低于對照組（P＜0.05），子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；肌酐，子癇前期組高于妊娠期高血壓組和對照組（P＜0.05），妊娠期高血壓組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；妊娠時間，子癇前期組低于妊娠期高血壓組和對照組（P＜0.05），妊娠期高血壓組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。年齡、尿素氮3 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 3 組孕婦胎盤組織中FGF-21 的陽性表達

FGF-21 主要表達于胎盤組織滋養細胞的細胞質中，見圖1 ～3。FGF-21 蛋白在對照組、妊娠期高血壓組、子癇前期組胎盤組織中陽性表達率分別為11.67%（7/60）、81.67%（49/60）和89.47%（51/57），組比較差異有統計學意義（χ2=91.106，P=0.000），子癇前期組和妊娠期高血壓組高于對照組，子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 3 組孕婦一般臨床及生化指標比較 （±s）

表1 3 組孕婦一般臨床及生化指標比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與妊娠期高血壓組比較，P ＜0.05。

組別 n 年齡/歲 BMI/ （kg/m2）妊娠時間/ d收縮壓/ mmHg舒張壓/ mmHg甘油三酯/ （mmol/L）膽固醇/ （mmol/L）對照組 60 28.00±2.28 23.49±1.75 273.85±4.72 109.82±12.30 73.30±6.33 3.57±1.18 5.89±1.14妊娠期高血壓組 60 29.40±5.55 28.08±3.11① 272.20±7.41 148.03±10.35① 97.27±7.73① 6.49±1.47① 8.14±1.27①子癇前期組 57 29.61±4.03 28.83±3.34① 260.70±12.73①② 153.35±12.17①②103.53±9.50①② 7.04±1.58①② 8.24±1.20①F 值 2.610 62.519 37.971 247.063 239.302 102.588 72.700 P 值 0.076 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 HDL/（mmol/L）LDL/（mmol/L） ApoA1/（g/L） ApoB/（g/L） 尿素氮/（mmol/L） 肌酐/（μmol/L）尿酸/（μmol/L）對照組 2.39±0.35 3.33±1.08 3.00±0.59 1.24±0.48 3.97±1.14 42.04±4.99 269.62±38.51妊娠期高血壓組 1.72±0.33① 4.71±1.13① 2.49±0.59① 1.66±0.64① 4.03±0.82 43.01±5.98 360.07±64.52①子癇前期組 1.59±0.36①② 4.99±0.97① 2.35±0.56① 1.82±0.41① 4.04±0.86 50.99±9.70①② 383.85±70.66①②F 值 93.629 41.487 21.059 19.829 0.088 27.508 60.983 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.915 0.000 0.000

圖1 FGF-21 在對照組胎盤組織中的表達（×400）

圖2 FGF-21 在妊娠期高血壓組胎盤組織中的表達（×400）

圖3 FGF-21 在子癇前期組胎盤組織中的表達（×400）

2.3 3 組孕婦胎盤組織中FGF-21 蛋白表達

子癇前期組灰度值（0.58±0.27），妊娠期高血壓組灰度值（0.53±0.26），對照組灰度值（0.17±0.10）。3 組比較差異有統計學意義（F=59.534，P=0.000）。子癇前期組和妊娠期高血壓組高于對照組（P＜0.05），子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 3 組孕婦胎盤組織中FGF-21 蛋白的表達

2.4 3 組孕婦胎盤組織中FGF-21 mRNA 表達

子癇前期組FGF-21 mRNA 表達量（5.28±3.92），妊娠期高血壓組（4.84±3.27），對照組（1.04±0.28）。3 組比較差異有統計學意義（F=21.961，P=0.000）。子癇前期組和妊娠期高血壓組高于對照組（P＜0.05），子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

2.5 3 組孕婦FGF-21 蛋白表達量與一般臨床、生化指標的相關性

妊娠期高血壓組FGF-21 蛋白表達量與甘油三酯、LDL 呈正相關（P＜0.05）；子癇前期組FGF-21 蛋白表達量與舒張壓、甘油三酯、LDL 呈正相關（P＜ 0.05）。見表2。

圖5 3 組孕婦胎盤組織中FGF-21 mRNA 的表達

表2 3 組孕婦FGF-21 蛋白表達量與一般臨床、生化指標的相關性分析

3 討論

目前許多研究結果表明，子癇前期孕婦存在血脂代謝的異常。本研究顯示子癇前期孕婦甘油三酯、膽固醇、LDL、ApoB 高于對照組，HDL、ApoA1 低于對照組。與KOCYIGIT[5]、BAYHAN[6]、SARANDOL 等[7]的研究結果一致。子癇前期的基本病理生理變化是血管內皮細胞功能紊亂，而血清脂類直接影響血管內皮功能，進而導致子癇前期發生、發展。

既往研究表明，脂肪因子在妊娠代謝性疾病中，如子癇前期、妊娠期糖尿病、胎兒生長受限等，均有差異表達。MELLER 等[8]的研究顯示，瘦素mRNA 在子癇前期和慢性高血壓孕婦胎盤中的表達水平高于血壓正常孕婦。HAUGEN 等[9]的研究發現，子癇前期孕婦血漿中的脂聯素、抵抗素、瘦素水平升高，但只有瘦素mRNA 在胎盤中表達水平較正常妊娠孕婦升高，脂聯素、抵抗素mRNA 與正常孕婦相比無差異。CHEN 等[10]研究發現，妊娠期糖尿病患者胎盤中脂聯素mRNA 的表達水平下降。STRUWE 等[11]研究表明，胎兒生長受限孕婦胎盤瘦素基因和蛋白的表達水平高于正常孕婦，而胎盤中的抵抗素、脂聯素或饑餓激素的基因表達水平與正常孕婦無差異。

FGF-21 作為一種新型的脂肪細胞因子，是FGFs超家族成員之一，人FGF-21 蛋白由209 個氨基酸組成，氨基端有28 個氨基酸組成的信號肽。FGF-21 mRNA 主要在胰腺β 細胞、肝臟、白色脂肪及骨骼肌中表達，近來發現，在胸腺[12]、血管內皮、腎臟[13]及睪丸組織中也有較低表達。FGF-21 主要從腎臟排泄。胎盤不僅傳遞營養物質，而且還能主動合成和分泌大量的分子。FGF-21 是在胎盤中合成的。FGF-21與肥胖[14]、非酒精性脂肪肝[15]、糖脂代謝異常[16]、腎臟疾病[17]、心血管疾病等[18-19]有關。NITERT 等[20]研究發現，妊娠期糖尿病孕婦胎盤FGF-21 mRNA 和蛋白水平較正常孕婦升高，但母體循環中的FGF-21 水平與正常孕婦無差異。關于FGF-21 與子癇前期的研究國內外報道罕見。本研究顯示，FGF-21 在子癇前期孕婦胎盤中蛋白和mRNA 表達水平高于對照組。相關性分析顯示，子癇前期孕婦胎盤FGF-21 蛋白的表達水平與舒張壓呈正相關，一定程度反映疾病的嚴重程度；與甘油三酯、LDL 呈正相關，推測其可能參與調節子癇前期孕婦的脂代謝進而參與疾病的發生、發展過程。子癇前期孕婦胎盤組織中FGF-21 mRNA表達水平升高，FGF-21 對甘油三酯的脂解作用增加，促使游離脂肪酸的釋放增加，炎癥反應及胰島素抵抗作用的增強，進而損傷內皮細胞，促使子癇前期的發生。但FGF-21 在子癇前期孕婦胎盤中蛋白和mRNA表達水平與妊娠期高血壓組無差異，可能是有共同的病理生理學基礎。FGF-21 mRNA 在子癇前期孕婦胎盤中的表達調控機制尚不清楚，可能與炎癥細胞因子、內皮損傷因子、胎盤低氧狀態等有關。FGF-21 主要從腎臟排泄，也是腎臟功能受損的獨立危險因素，本研究顯示，雖然子癇前期孕婦肌酐、尿酸水平高于對照組，但胎盤中FGF-21 mRNA 表達水平與肌酐、尿素氮、尿酸無關,推測子癇前期孕婦在肌酐、尿素氮、尿酸變化前，胎盤中FGF-21 mRNA 表達水平就已升高?？傊?，FGF-21 與子癇前期的相關性研究還處于起步階段，需要更多的臨床和基礎研究。