POR基因突變致先天性腎上腺皮質增生癥兩家系遺傳學分析

李莉，劉玲，毛會英

1.瀘州市婦幼保健院兒科，四川 瀘州 646000；2.廣東醫科大學附屬第三醫院兒科，廣東 佛山 528000

p450 氧化還原酶(p450 oxidoreductase，POR)基因位于7號常染色體長臂(Chr.7q11.2)，長約7.1 kb，共16個外顯子，編碼680 個氨基酸組成黃素蛋白(NCBI Reference Sequence: NG_008930.1)[1]，并參與電子傳遞反應。POR基因突變可影響21-羥化酶和17α-羥化酶的活性而導致p450 氧化還原酶缺陷癥(p450 oxidoreductase deficiency，PORD)[2]，其臨床主要表現為骨骼發育不良(skeletal dysplasia)、腎上腺功能紊亂(adrenal dysfunction)、性發育異常(disorders of sex development，DSD)以及母孕期的女性男性化[3-5]，先天性腎上腺皮質增生癥(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是少見類型之一，為常染色體隱形遺傳病[6]，目前對PORD 病例報道較少。本研究對21-羥化酶A2、11-羥化酶B1 及17-羥化酶A1 基因無異常的CAH 患者進行POR 基因檢測，為臨床診斷提供依據，提供遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1～12月瀘州市婦幼保健院及廣東醫科大學附屬第三醫院兒科門診確診的CAH患兒，收集21-羥化酶A2、11-羥化酶B1及17-羥化酶A1基因正常的2例患兒臨床資料，并對其家系進行POR基因檢測。

1.2 方法 經家長知情同意并簽字后，留取患兒及其父母靜脈血2 mL。提取全血基因組DNA 和RNA，設計14 對引物對POR 基因的16 個外顯子及其側翼進行PCR 擴增后Sanger 測序，上下游引物如表1所示。結果與GenBank中POR基因序列進行比對，并在其家屬中進行驗證。根據突變位置設計RNA引物，進行RNA逆轉錄后進行測序，測序結果在GenBank中進行比對，進一步驗證突變位點，RNA 引物：For1，5'-CCACCTCATGCACCTGGAAT-3'；Rev1，5'-CCCGGTACAGGTAGTCCTCA-3'。

表1 POR基因各外顯子PCR擴增引物

2 結果

2.1 臨床資料 先證者1，男性，1個月13 d，以體質量不增為首發癥狀，起病時間早，伴嘔吐、腹瀉，查體發現生殖器畸形(尿道下裂-會陰型)，全身皮膚輕微色素沉著，雙側陰囊色素沉著明顯(圖1 A)，輔助檢查：電解質提示低鈉高鉀，17OHP 升高、醛固酮降低等(表2)，染色體檢查為正常男性核型。先證者2，男性，2歲11個月，以“陰莖短小”為主要表現(圖1 B)，無腹瀉、嘔吐、體質量不增等癥狀，查體發現陰莖外觀短小，總長約4.5 cm，包埋部分約2.0 cm，陰莖彎曲，睪丸容積較同齡兒偏大(表2)，輔助檢查見表3。

2.2 基因檢測結果

2.2.1 先證者1 外顯子13,c.1508C＞T (純合突變)，該突變導致POR 第503 位丙氨酸突變為纈氨酸(Valin，V/Val，GCC→GTC，p.A503V)，如圖2。該突變遺傳自先證者1父母。

2.2.2 先證者2 外顯子15,c.1820A＞G (純合突變)，導致POR 第607 位氨基酸由酪氨酸(tyrosine，Y/Tyr)突變為半胱氨酸(cysteine，C/Cys，TAC→TGC，p.Y607C)，如圖3。該突變遺傳自先證者2父母。

2.2.3 POR基因突變 POR基因外顯子13,c.1508C＞T 及外顯子15,c.1820A＞G 經Alamut Visual 及Mutatior Taster 功能軟件預測會影響蛋白結構域的功能，通過Phyre2 功能軟件可知503 位丙氨酸及607 位酪氨酸位于相對保守區域，如圖4。

圖1 兩位先證者生殖器檢查

表2 兩位先證者的實驗室檢查

2.3 治療 先證者1 給予糖皮質激素(氫化可的松片)、鹽皮質激素(9α-氟氫化可的松)及氯化鈉治療，2 周后血鈉、血鉀恢復正常；先證者2給予糖皮質激素(氫化可的松片)治療。

表3 兩位先證者的臨床評估

圖2 外顯子13基因測序圖

圖3 外顯子15基因測序圖

圖4 POR突變圖

3 討論

CAH 是由于編碼腎上腺皮質激素合成酶的一組基因發生突變，導致酶缺陷繼而引起皮質激素合成不足，繼發垂體促腎上腺皮質激素(adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH)和下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)分泌增加，最終導致腎上腺皮質增生的常染色體隱形遺傳病。CAH除了常見的21-羥化酶缺乏癥(21-OHD)外，還有11α-羥化酶缺乏癥(11α-OHD)、17-羥化酶缺乏癥(17-OHD)、類脂性腎上腺皮質增生癥(StAR)和p450氧化還原酶缺陷癥(PORD)等少見類型。POR 是內質網中類固醇和藥物代謝細胞色素p450 蛋白的代謝反應所必需的酶，是兩種主要的類固醇生成酶17-羥化酶和21-羥化酶的電子供體[7]。POR突變使p450酶系活性受到影響，最終影響藥物的代謝及類固醇激素的合成，導致一系列復雜的疾病，類似于多種類固醇代謝酶的聯合缺陷[8-9]。

本研究中先證者1臨床表現及實驗室檢查結果類似21-OHD 經典型，但21-羥化酶A2 基因無異常。POR基因提示外顯子13,c.1820A＞G(p.A503V，純合突變)，該突變來自先證者父母(雜合突變)。該位點為POR基因常見突變位點，影響類固醇合成酶及藥物代謝酶活性。研究發現，c.1820A＞G 突變使17-羥化酶與21-羥化酶活性分別降低32%與20%，并使17、20裂解酶活性降低42%[10-11]，導致皮質醇和醛固酮合成受損，皮質醇低下，經負反饋使ACTH分泌增加，刺激腎上腺皮質細胞增生，以增加皮質醇合成，但17-羥化酶與21-羥化酶活性降低使皮質醇依然低下，且孕酮轉化為醛固酮降低，導致水鹽平衡失衡；但雄激素合成通路正常，在高ACTH刺激下，堆積的17-OHP和孕酮向雄激素轉化增多，產生了旁路代謝亢進-高雄激素血癥(雄烯二酮、睪酮和脫氫表雄酮升高)，臨床表現與21-OHD 相似。先證者2，外顯子15,c.1820A＞G (p.Y607C，純合突變)，該突變來自先證者父母(雜合突變)。POR 第607 位酪氨酸位于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)結合域，酪氨酸的羥基和NADPH 第一正磷酸基團之間形成氫鍵，使NADPH 和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)緊密結合，傳遞電子[12-13]。POR 第607 位酪氨酸突變為半胱氨酸改變了NADPH 與FAD的結合，從而使POR活性下降60%～90%[14-15]，抑制17-羥化酶、21-羥化酶與19-羥化酶活性，但以19-羥化酶為主，皮質醇和醛固酮通路基本正常，睪酮轉化為雌二醇通路受阻，使其不能轉化為雌二醇，導致高雄激素血癥，因此先證者2 臨床表現較先證者1 輕。本研究兩位先證者均為純合突變，突變均來源其雜合突變的父母，符合常染色體隱性遺傳規律。

PORD 的臨床表現聯合了21-OHD 和17-OHD，根據不同突變對酶活性的影響程度，PORD的臨床表現多樣，容易導致臨床上CAH患者由于臨床表現、體征和實驗室檢查不典型而出現誤診漏診。PORD 治療同21-OHD，最重要的是糾正腎上腺皮質功能減退危象，維持機體正常的生理代謝，降低死亡率并且抑制垂體ACTH 分泌，延緩腎上腺雄激素過度分泌導致的性早熟。治療不當與治療過度均可導致矮小及生理、心理發育障礙等后遺癥。因此定期隨訪很重要，根據臨床癥狀及檢查結果及時調整治療方案，以最低藥物劑量達到最好的代謝控制，避免或減少藥物副作用，使患者能達到正常的生長及青春發育，提高生活質量。

本研究通過對2例PORD患兒的臨床表現和基因突變特點分析，POR 基因外顯子13,c.1508C＞T、外顯子15,c.1820A＞G突變是這兩例患者的致病原因，提高了臨床醫師對本病的認識，并擴大了基因突變譜，為遺傳咨詢提供了基礎。