石骨癥特異誘導多能干細胞的建立及其功能研究

吳愛國，何叢馨，楊少軍，李嵐，余國偉

中信惠州醫院骨科，廣東 惠州 516006

石骨癥(osteopetrosis)是一類以破骨細胞活性異常、骨吸收缺陷和骨硬化等骨代謝異常為特征的遺傳性疾病。根據遺傳方式的不同可以分為常染色體顯性遺傳石骨癥、常染色體隱性遺傳石骨癥和X連鎖石骨癥[1]。常染色體顯性遺傳骨硬化癥2 型(autosomal dominant osteopetrosis type Ⅱ，ADO2)是我國臨床上最常見的石骨癥亞型，多見于成人，又稱為成年型石骨癥。氯離子第7 通道蛋白(chloride channel 7，CLCN7)基因突變是導致ADO2 的主要原因之一。有研究證實，CLCN7雜合突變導致顯性遺傳石骨癥的過程中存在明顯的骨吸收障礙，引起破骨細胞數目增加，但是不少細胞不能形成功能完整的褶皺緣[2]。CLCN7的基因產物為破骨細胞褶皺緣上的氯離子通道蛋白，該基因雜合突變引起部分破骨細胞氯離子通道功能的缺陷，從而影響骨吸收酸性微環境的生成，進而可能導致破骨細胞發育過程中的一系列調控網絡異常[3]。為了明確攜帶CLCN7 雜合突變的ADO2 患者破骨細胞發育異常過程中涉及的信號通路及信號分子，COUDERT 等[4]把ADO2 患者和對照者外周血單個核細胞誘導培養成為破骨細胞，利用基因表達譜芯片技術分析發現了兩者之間存在多達182個基因差異表達，該結果在mRNA水平和蛋白水平均得到驗證證實；此外，他們在對照者破骨細胞誘導培養過程中轉染攜帶CLCN7突變的載體，發現其結果與攜帶CLCN7 雜合突變的ADO2患者破骨細胞類似。目前，國內外尚缺乏石骨癥相關細胞及動物模型。研究表明，來源于人類疾病患者的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有細胞疾病模型作用[5]。因此，本研究利用石骨癥患者尿液腎管狀細胞建立ADO2特異性多能干細胞(ADO2-iPSCs)，探索基因突變對氯離子通道相關通路的影響，為骨代謝異常疾病的臨床診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年10 月至2019 年10月在中信惠州醫院確診為ADO2 且CLCN7 基因突變的患者10 例作為實驗組，其中男性6例，女性4 例；年齡25～78歲，平均(48.67±5.46)歲。同時將10例性別年齡等基本條件與選取的ADO2患者相匹配的正常健康者作為對照組。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者和對照者均知情并簽署同意書。

1.2 iPSCs細胞的構建及鑒定

1.2.1 體細胞的準備 室溫采集兩組受試者的無菌清晨中段尿，于6 h內進行離心分離，獲得尿液細胞，進行原代細胞培養。

1.2.2 誘導多能干細胞的建立 ①病毒包裝和感染：包裝逆轉錄病毒感染尿脫落細胞293T分盤培養后，第2 天進行磷酸鈣轉染法質粒轉染。第4 天將體細胞培養基替換為新鮮培養基后加入病毒上清，Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 四種病毒；另選一孔體細胞只加入2 mL pMX-GFP 病毒，作為感染對照，測試病毒感染效率。感染過夜后換新鮮體細胞培養基。第5天進行第二次轉染。②感染后細胞的接種和培養：感染后細胞接種飼養層細胞病毒感染后第2 天，將培養基更換為DFBS 培養基；第5 天復蘇飼養層細胞到100 mm盤；第6天感染后的體細胞用胰酶消化后計數，接種到飼養層細胞上。此時細胞培養基為DFBS+Vc+VPA，培養基每天更換。VPN 處理8～10 d 后撤去，第18 天將培養基換為KSR 培養基。③克隆的選取和維護：擴大復蘇飼養層細胞到12孔板，第2天換為KSR培養基；病毒感染后第22～30天，鏡下選擇形態與人胚胎干細胞相近的克隆，拍照記錄并編號；細胞間紫外照射30 min，將選好的克隆切割并剝離飼養層細胞，吸出，于12 孔板中培養傳代，擴增。

1.2.3 誘導多能干細胞的鑒定 ①iPS細胞克隆形態及堿性磷酸酶染色觀察；②細胞免疫熒光鑒定人ES 細胞標志性抗原表達；③提取SLE-iPSCs 總RNA，采用RT-PCR 檢測人ES 細胞標志性基因表達水平及外源基因是否沉默；④人iPS 細胞核型分析。⑤懸浮培養觀察擬胚體形成及體外分化；⑥iPS 細胞接種至SCID 小鼠皮下，觀察畸胎瘤形成及體內分化情況。

1.2.4 人破骨細胞誘導培養鑒定及功能分析 將上述iPSCs誘導培養為破骨細胞，通過TRAP染色、HE染色、熒光染色以及噬骨能力鑒定細胞，并采用實時熒光PCR 技術檢測各種來源的破骨細胞CLCN7 mRNA 表達情況，采用Western blot 檢測CLCN7 蛋白表達。

1.3 破骨細胞基因表達譜及其突變效應分析 對誘導獲得的破骨細胞，提取細胞總RNA，構建破骨細胞基因表達文庫，并采用基因表達譜芯片分析突變型CLCN7 破骨細胞基因表達譜情況，獲得CLCN7 突變對破骨細胞發育及成熟影響的關鍵通路及信號分子信息。

1.4 CLCN7突變體對人破骨細胞基因表達的影響 利用miRNA、RNAi 技術，以及實時熒光定量PCR、蛋白質印跡法(Western blot)技術分析上一步驟篩選到的關鍵通路信號分子以及文獻已報道的與CLCN7 突變所致石骨癥破骨細胞發育相關的調控因子(ITGB5、PERF1、WARS 和SERPINE2)表達情況，構建ADO2破骨細胞發育基因調控網絡圖。

1.5 統計學方法 應用SPSS20.00 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組患者的表型和CLCN7 突變 ADO2患者總共有6種不同的CLCN7突變，這些突變位于不同位置CLC7 蛋白，其中三個位于細胞內C-末端區域，另一個位于跨膜區域。5 名相關患者有p.G215R突變和3個無關的患者p.R767W突變。

2.2 兩組受試者的7 個差異基因比較 qPCR 技術檢測mRNA 的結果顯示，與對照組比較，實驗組患者ITGB5的比例高46%，CES1的比例高143%，PERF1的比例低48%，SERPINE2 的比例低53%，WARS 的比例低39%，GBP4比例低28%和UCHL1的比例高58%，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 ADO2 細胞中的ITGB5、SERPINE2、CES1、WARS、PERF1表達情況 為驗證qPCR觀察到的表達變化，通過Western blot 評估受試者的蛋白質表達水平。與對照組的供體破骨細胞比較，ADO2 細胞中的ITGB5 的表達增加278%，SERPINE2 表達下降51%，WARS 表達下降68%和PERF1 表達下降49%，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而兩組受試者的CES1表達比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。但蛋白質印跡法無法觀察UCHL1 和GBP4。采用免疫熒光染色法，觀察到ITGB5、SERPINE2、CES1、WARS、PERF1 存在于ADO2和健康供體的破骨細胞中，見圖2。

圖1 ADO2 細胞中的ITGB5、SERPINE2、CES1、WARS、PERF1表達情況

圖2 免疫熒光染色后破骨細胞質中ITGB5、SERPINE2、CES1、WARS和PERF1的表達

2.4 兩組轉染中的基因表達修飾模型表達水平比較 實驗組ITGB5 表達水平為(1.25±0.31) EU/μg，明顯高于對照組的(0.93±0.23)EU/μg，而PERF1 基因表達水平為(1.07±0.26) EU/μg，明顯低于對照組的(1.51±0.39)EU/μg，差異均有統計學意義(P＜0.05)。而兩組的WARS和SERPINE2比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

骨吸收作用一般包括對骨組織羥基磷灰石等無機物和膠原纖維等有機物的代償作用[6]。破骨細胞是高度分化的多核巨細胞直接參與骨吸收，是骨組織吸收的最主要功能細胞之一。在破骨細胞相對密封的區域內，α3亞基上的空泡質子泵提供H+，ClC-7被動轉運提供Cl-，兩者結合轉運至破骨細胞內小囊泡，在膜表面與褶皺緣形成骨吸收亞環境，分泌、釋放有機酸及相關酶類，啟動骨吸收作用。在該過程中，ClC-7和質子泵等水平的降低或功能的異常都有可能會造成破骨細胞額骨吸收功能出現障礙，導致破骨細胞功能缺陷或細胞數目異常進而產生骨硬化癥[7]。

在臨床治療石骨癥方面，一般僅限于控制感染、防止外傷性骨折、輸血、改善神經壓迫、補充低鈣及磷酸纖維素類食物等對癥治療，這些方案只能在一定程度上延緩骨硬化的進程。此外，造血干細胞移植也是治療嚴重石骨癥的重要方法之一，然而移植治療風險較大且效果并不能令人滿意。研究表明，僅7%接受造血干細胞移植術石骨癥患者的病情會得到明顯改善，69%接受造血干細胞移植術石骨癥患者的病情出現繼續惡化現象，而25%接受造血干細胞移植術石骨癥患者仍有可能出現持病情持續加重現象[8]。由此可見，石骨癥目前臨床仍缺乏行之有效的治療措施。iPSCs具有類胚胎干細胞的功能，由于iPSCs直接來源于患者，所獲得的疾病iPSCs 及其終端分化細胞可應用于疾病病理機制研究、藥物安全性檢驗、藥物篩選乃至個體化治療方案的制定與選擇[9]。目前，將iPSCs成功定向發育為破骨細胞，建立ADO2 特異性多能干細胞(ADO2-iPSCs)很可能為石骨癥發病的分子機制研究提供新的工具。

基因表達譜分析可用于調查人類樣本中突變引起的變化。在本研究中，對于7 個差異表達基因GBP4、UCHL、CES1 等的RNA 可在人類破骨細胞中表達。SERPIN 是纖溶酶原系統的一部分，與基質重塑和血栓形成有關。而SERPINE2屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，表達于各種各樣的組織。研究顯示，SERPINE2 強烈影響纖維蛋白溶解和血栓溶解，SERPINE2在ADO2破骨細胞中明顯降低[10]，推測可能是一種ADO2破骨細胞吸收功能的代償性降低。

穿孔素1 (perforin 1，PERF1)是66 kDa 的成孔蛋白質，其聚合并形成一種跨膜的孔狀結構靶細胞的質膜脂質雙層膜，通道依賴于Ca2+，并將顆粒酶輸送到靶細胞的胞質溶膠。PERF1表達于細胞毒性自然殺傷淋巴細胞。在破骨細胞中證實PERF1表達提高[11]。本研究結果顯示，CLCN7基因突變的患者與健康對照組相比，ADO2細胞中的PERF1表達水平下降約49%。

本研究結果還顯示，CLCN7 基因突變的患者ADO2 破骨細胞中WARS 基因表達水平明顯下降，這可能是由于破骨細胞可以合成血清素，促進色氨酸羥化酶表達，從而導致破骨細胞分化，ADO2破骨細胞中WARS 基因表達水平明顯下降[12]。WARS 可能與破骨細胞生物學有關，但無法在轉染實驗中證實。研究顯示，干擾素能夠誘導短WARS 的形式[13]，此外，SERPINE2 和PERF1 也是通過直接或間接調節的干擾素。亦有一個全基因組基因研究顯示[14]，CLCN7突變小鼠的表達譜分析，在破骨細胞組織中觀察到了幾種較高的表達干擾素誘導基因指向同一途徑，但方向相反。

由于ITGB5 在RNA 和蛋白質水平表達存在一個趨勢，即在CLCN7 突變的人破骨細胞中ITGB5 水平升高。ITGB5 是在未成熟的破骨細胞中高表達。亦有研究顯示，在雌性小鼠中缺乏ITGB5的表達誘導會增加破骨細胞功能[15]。單一出現了具有未知突變的ADO2 患者破骨細胞ITGB5 的變化，包括表達增加整合素ITGB5 的細胞骨架組織和活動性破骨細胞都依賴于整合素β3及其涉及Rho GTP酶和Rho GTP酶的下游信號通路vav3。

綜上所述，取自ADO2 患者和健康者的破骨細胞中表達基因存在差異，并驗證CLCN7 突變所致ITGB5、WARS、SERPINE2和PERF1的表達情況變化，ITGB5表達上調和PERF1的表達下降，可能與破骨細胞功能障礙有關。