基因多態性與不明原因習慣性流產的相關性分析

宿喜萍 唐曉琳 陳金蓮 陳多珍

【摘要】目的：探討MTHFR基因多態性與不明原因習慣性流產間的相關性。方法：本次納入對象為我院婦產科2018年11月～2019年4月收治的不明原因習慣性流產患者30例，選取同期于我院婦產科住院的正常妊娠女性30例設為健康組，檢測兩組MTHFR基因多態性，主要使用技術為聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術（PCR-RFLP）。結果：URPL組TT基因型頻率為26.7%，比健康組10.0%更高;CC基因型頻率為20.0%，比健康組40.0%更低，比較有統計學差異（P<0.05）;兩組CT基因型頻率為53.3% vs 50.0%，比較無統計學差異（P>0.05）。結論：MTHFR基因多態性密切關聯于URPL，T等位基因可能為遺傳易感因素之一。

【關鍵詞】MTHFR基因多態性;不明原因習慣性流產;相關性

[中圖分類號]R714.21 ? [文獻標識碼]A ? [文章編號]2096-5249（2020）15-000-02

習慣性流產即女性自然流產次數≥2次（或3次）者，其中孕周在12周以內流產者占70%左右，被國際上稱作復發性自然流產，發生率為2%～5%左右[1]。有多種因素會導致自然流產，如感染、遺傳缺陷、子宮畸形、個人行為與環境、內分泌或激素分泌異常、血栓形成傾向及自身免疫疾病等。習慣性流產夫婦開展各種檢查后仍無法明確流產病因者被稱作原因不明習慣性流產（URPL），占比為50%～75%[2]。當前國內外均報道了亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）多態性與URPL的關系。MTHFR作為關鍵酶主要經同型半胱氨酸（Hcy）和葉酸代謝，其功能在于不可逆還原5，10-亞甲基四氫葉酸至5-甲基四氫葉酸，密切關聯于DNA合成與甲基化。當前已經明確MTHFR基因多態性中C677T會降低MTHFR活性，阻礙Hcy向甲硫氨酸轉變，誘發高同型半胱氨酸血癥并降低葉酸水平，導致妊娠期胎盤形成血栓風險增加，導致胚胎停育、胎盤栓塞等，最終誘發習慣性流產。現選取URPL患者與正常妊娠女性各30例，探討MTHFR基因多態性與URPL的關聯。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次納入對象為我院婦產科2018年11月～2019年4月收治的URPL患者30例，早期妊娠習慣性流產史≥3次，夫婦雙方外周血染色體核型均無異常，均無家族遺傳病史;經子宮輸卵管造影、婦科及B超等檢查明確無生殖器解剖畸形;內分泌功能無異常，B超對排卵情況予以監測無異常，月經周期無異常，基礎體溫為雙相，排除內分泌病史如甲狀腺功能亢進及糖尿病史者;弓形蟲病原或巨細胞病毒檢查結果為陰性者;抗磷脂抗體及抗核可抽提抗原抗體檢查連續超過3次，每次間隔超過4周結果均為陰性;規律生活，無藥物濫用、抽煙及酗酒史。30例患者年齡為22～37歲，平均年齡為（28.6±4.7）歲;妊娠時間為32～100d，平均妊娠時間為（53.7±6.4）d;選取同期于我院婦產科住院的正常妊娠女性30例設為健康組，年齡為21～36歲，平均年齡為（27.4±3.6）歲;妊娠時間為34～104d，平均妊娠時間為（55.8±7.2）d。兩組對象一般資料比較無統計學差異（P>0.05），具有可比性。

1.2一般方法 采集兩組空腹狀態下肘靜脈血，行抗凝處理，使用0.2%EDTA，將血細胞DNA提取出來。先使用低滲溶血法將白細胞分離出來，氯、酚法將人基因組DNA提取出來。使用（PCR-RFLP）技術檢測兩組MTHFR基因多態性，合成擴增的引物序列如下：P1： 5'-CAAAGGCCACCCCGAAGG-3'，反義為5'-AG-GACGGTCCGGTGAGAGTG-3'。25μl為PCR反應體系總體積，10×Buffer，引物為0.3μmol/LMG2+，模板DNA為0.1μg，dNTPs為200μmol/L，aq酶為1UT，0.25μmol/LMG2+;5min、94℃為預變性參數，1min、94℃為變性參數，1min、57℃為復性參數，1min、72℃為延伸參數，循環35次后再次設定7min、72℃為延伸參數。對PCR產物予以觀察，使用2%瓊脂糖凝膠電泳，將10μlPCR產物取出，添加2μl10×Buffer與10UHinf I酶，補水后使產物達到20μl，持續消化16h并控制溫度為37℃，結果使用2.5%瓊脂糖膠電泳觀察。

1.3統計學方法 對本組獲取的數據開展統計學處理，應用SPSS21.0軟件，計數資料表示方法為n（%），卡方檢驗χ2開展組間對比，若P<0.05提示比較有統計學差異。

2 結果

兩組MTHFR基因型頻率比較246bp為擴增PCR結果片段長度，使用HinFI酶切消化該產物，會形成MTHFR基因型，共3種，包括雜合子型CT、純合突變型TT及野生型CC，246bp中包含C等位基因者HinfI不可消化，而含T等位基因者則被消化為72BP與174BP。兩組MTHFR基因型頻率、等位基因頻率比較如表1所示。

3 討論

URPL有復雜的發生機制，當前各種相應治療方案均無確切療效，婦產科一直將其作為疑難問題。人類基因組計劃全部完成，現代醫學開始思考人類疾病發生發展可能關聯于基因，故而可淺顯地認為人類所有疾病均屬于基因型。近年來臨床對URPL免疫遺傳學病因的研究報道逐漸增加且成為關注熱點，并從傳統遺傳模式角度向探索易感基因與易感染色體角度轉變。

MTHFR基因主要在染色體1P36.3處定位，外顯子共11個，5-甲基四氫葉酸為活化葉酸，轉化甲基為半胱氨酸后將蛋氨酸生成，進而對蛋氨酸-半胱氨酸代謝予以調節。MTHFR酶依賴葉酸，存在遺傳突變性，當前發現的主要突變位點為MTHFR677C→T，其多態會將酶熱不穩定性增加。本組選取的患者均排除其他會導致習慣性流產的因素，發現TT基因型頻率為26.7%，比健康組10.0%更高，說明TT型基因可能為獨立預測因素。綜合而言，MTHFR基因突變誘發URPL的機制可能如下：MTHFR基因密切關聯于5-甲基四氫葉酸，而該因子屬于甲基供體在機體核酸、嘧啶及嘌呤等因子代謝中均有所參與。因胎盤中缺少MTHFR活力，致使機體蛋白質與DNA甲基化缺少，此為胚胎發育必要因子，故而導致流產、胚胎停育，同時還會將半胱氨酸濃度增加，損傷血管內皮細胞并產生毒性，將血小板聚集與黏附增強，誘發胎盤血管栓塞性病變，這是重復性URPL與神經管缺陷的主要危險因素[3]。另一方面，MTHFR基因突變降低酶的活力，影響機體營養、遺傳等因素。高半胱氨酸血癥為主要遺傳因素之一，作為已知的風險因子會導致白種人形成動靜脈血栓。MTHFR677C→T為常見的遺傳缺陷，該突變導致酶蛋白中丙氨酸被絡氨酸取代，并使MTHFR形成46℃不耐熱的變異，誘發高半胱氨酸血癥后導致胎盤栓塞誘發流產[4]。此外，半胱氨酸會毒性作用于胚胎，在神經胚胎形成期其損害致畸作用突出。另有研究表明[5]胎兒MTHFR基因突變也會增加自然流產風險，說明習慣性流產可能關聯于母胎雙方基因型異同，若均為純合677T等位基因型則有更高的自然流產發生率。臨床已經證實葉酸的攝取量為MTHFR基因突變主要營養因素，因此妊娠婦女一定要對葉酸予以適當補充，還可選擇維生素B12及B6，實用且經濟。

綜上所述，MTHFR基因多態性密切關聯于URPL，T等位基因可能為遺傳易感因素之一。

參考文獻

[1] 黃山鷹， 唐國玲， 劉慶芝， 等. MTHFR的基因多態性與原因不明復發性流產的相關性分析[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志， 2017， 36（5）： 382-384.

[2] 李乾， 常亮， 劉平， 等. 母胎亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態性與不明原因習慣性流產發生風險的相關性研究[J]. 生殖醫學雜志， 2018， 27（10）： 981-985.

[3] 郭謙楠， 馮戰啟， 康冰， 等. 河南漢族父親MTHFR基因對母親不明原因反復自然流產的影響[J]. 重慶醫學， 2016， 45（13）： 1736-1739.

[4] 肖海， 婁桂予， 張倩， 等. 不明原因復發性自然流產患者HVEM基因多態性檢測研究[J]. 重慶醫學， 2019， 48（16）： 2808-2810.

[5] 郭春燕， 艾紅梅. 雌激素受體β基因多態性和不明原因復發性流產的關系探討[J]. 實用婦產科雜志， 2018， 34（4）： 272-276.