制川烏不同浸泡、蒸制時間比較與工藝優化

尹 磊，朱月健*，葛德助，楊國祥，李冬梅

(1.安徽普仁中藥飲片有限公司，安徽 亳州 236800；2.中藥提取安徽省技術創新中心，安徽 亳州 236800；3.安徽濟人藥業有限公司，安徽 亳州 236800；4.皖南醫學院，安徽 蕪湖 241000)

川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根，始載于《神農本草經》，列為下品。本品初生發芽長出地面時，形如烏鴉之頭，故名烏頭。因主產于四川省，故又名川烏。6月下旬至8月上旬采挖，除去子根、須根、泥沙，曬干。其味辛、苦、熱，有大毒。川烏主要有效成分為雙酯型生物堿，其也是川烏的毒性成分。通過加熱、水解等方式能使雙酯型生物堿轉變為毒性較低的單酯型生物堿，若進一步水解為相應的醇胺，則幾乎無毒性[1]。因此川烏的合理炮制對控制用藥安全有效尤為重要。

烏頭屬植物多含有生物堿，生藥所含的雙酯型生物堿具有較大的毒性，自古代即對其炮制過程有了較多記載，包括“炮”“燒”“泡”等方法。近代通過現在的設備和技術應用，對其炮制過程和原理也有了較多的研究，王峰峰等[2-3]對烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿水解和醇解產物進行分析，明確了烏頭堿水解成單酯型新烏頭堿，最后到次烏頭堿的水解過程。秦語欣等[4]分析了川烏炮制前后化學成分的變化，也指出了生物堿水解過程。

對于烏頭的炮制工藝研究，涂瑤生等[5]采用加壓蒸制法炮制川烏，使其在111 ℃(0.05MPa)下炮制15～150 min即能達到藥典標準。區炳雄等[6]研究表明，微波炮制能明顯降低川烏中毒性成分雙酯型生物堿的含量，與藥典規定炮制方法比較，其總生物堿含量較高。龔潮池等[7]通過研究發現制川烏最佳浸泡方式為40 ℃溫水浸泡25～26 h，可明顯縮短制川烏浸泡時間。鄧廣海等[8]研究發現，高壓蒸制30 min后，川烏毒性成分雙酯型生物堿含量明顯降低，且與蒸制時間有顯著的相關性，時間延長，含量逐漸降低，到180 min后，其含量幾乎檢測不到，但是隨著時間延長，總生物堿含量也有所降低。上述研究的工藝方法均為實驗室小批量炮制過程，對于企業實際大生產工藝指導有一定的局限性，而且川烏炮制不當，即炮制程度不夠(殘留毒性太大)或炮制太過(有效成分流失)，使得市場上很多川烏炮制品的質量不達標，臨床上時常發生川烏及制川烏中毒和療效降低等現象[14]。因此本實驗結合2015版《中國藥典》標準、文獻資料和飲片企業加工實際，進行工藝研究，通過工藝小試和大生產實際，探究制川烏蒸制時間、浸泡時間對有毒成分及有效成分的影響，形成穩定可靠的生產工藝。

1 材料與試劑

川烏藥材(由安徽普仁中藥飲片有限公司提供)，取自原料庫，經安徽中醫藥大學謝冬梅老師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根。

電磁爐(廣東美的生活電器制造有限公司)、蒸鍋(佳合不銹鋼制品有限公司)、全自動平面往復式刨片機(亳州市姜氏制藥設備有限公司)、UITiMate3000高效液相色譜儀(美國戴安(中國)有限公司)、電子分析天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)、GZX-9246MBE電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)

苯甲酰烏頭原堿對照品(批號：11794-201802)、苯甲酰次烏頭原堿對照品(批號：11796-201803)、苯甲酰新烏頭原堿對照品(批號：11795-201804)、烏頭堿對照品(批號：112019-201801)、次烏頭堿對照品(批號：110798-201809)、新烏頭堿對照品(批號：110799-201708)，6種生物堿對照品購買于中國食品藥品檢定研究院；異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈和四氫呋喃為分析純；超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動相A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為235 nm。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液制備

取對照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL含烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿各50 μg、次烏頭堿和新烏頭堿各0.15 mg、苯甲酰新烏頭原堿0.3 mg的混合溶液，即得，備用。

2.3 川烏炮制方法考察

2.3.1 浸泡時間考察 分別取2批次生川烏大小分開，加水使其沒過藥材浸泡，每天換水1次，記錄1次時間，記錄總浸泡時間，取出蒸制7h，取出，晾至六成干，切片，干燥，得制川烏。川烏浸泡時間對浸泡程度影響見表2。

表2 制川烏浸泡時間對浸泡程度影響

2.3.2 蒸制時間考察 取生川烏大小分開，用水浸泡至內無干心，記錄浸泡時間，取出，分別蒸制4、5、6、7、8、9 h，取出，晾至六成干，切片，干燥，得制川烏。每批次平行操作2次，得制川烏12批。

2.4 供試品溶液的制備

取制川烏粉末(過三號篩)約2g ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25 ℃以下)30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液3 mL溶解，濾過，取續濾液，即得。

2.5 精密度試驗

精密吸取樣品溶液20 μL，連續進樣5次，記錄峰面積、保留時間。結果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD(n=5)分別為2.80%、1.90%、2.04%、1.44%、2.47%、2.82%。保留時間的RSD(n=5)分別為0.43%、0.05%、0.84%、0.98%、0.95%、1.44%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一樣品溶液，在室溫下分別于0、2、4、8、10、24、48 h進樣測定，記錄峰面積、保留時間。結果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為2.76%、2.74%、1.90%、2.72%、2.60%、2.54%。保留時間的RSD分別為0.65%、0.51%、0.15%、1.10%、0.15%、1.31%。結果表明樣品溶液48 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取樣品粉末6份，分別按“2.4”項下方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液各20 μL，進行測定，記錄峰面積、保留時間。結果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD(n=6)分別為1.87%、2.65%、1.99%、1.63%、1.93%、2.18%。保留時間的RSD(n=6)分別為0.20%、0.31%、0.29%、0.84%、0.13%、1.18%。結果說明該方法測定烏頭中6種生物堿的重復性良好。

2.8 樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結果見表3、表4、圖1、圖2。

表4 不同蒸制時間對制川烏生物堿含量影響

表3 不同浸泡時間對制川烏生物堿含量影響

根據表3，繪制兩批號制川烏單酯型生物堿成分的浸泡時間-含量關系，見圖1。

圖1 制川烏單酯型生物堿成分的浸泡時間-含量關系

本實驗選取2個不同批號川烏進行實驗，各個批號川烏均在浸泡3天(室溫)后達到2015版《中國藥典》內無干心的要求(表2)，由表3檢測結果可見，8個批次浸泡不同時間所得制川烏雙酯型生物堿和單酯型生物堿含量均在2015版《中國藥典》規定范圍內。

由圖1可見，同一批號不同浸泡時間所得制川烏單酯型生物堿總量差距較小，說明浸泡時間對制川烏雙酯型生物堿影響較小。根據企業實際生產情況考慮，制川烏浸泡3天符合2015版《中國藥典》且能大大縮短生產制川烏成品時間。綜上所述，企業生產制川烏室溫浸泡3天應為最優參數。

根據表4繪制兩批次制川烏單酯型生物堿成分的蒸制時間-含量關系，見圖2。

圖2 制川烏單酯型生物堿成分的蒸制時間-含量關系

由表4及圖2可見，制川烏蒸制6 h后雙酯型生物堿已經完全檢測不到，說明雙酯型生物堿在蒸制6 h后已經水解完全。制川烏中單酯型生物堿在蒸制7 h前呈逐漸升高趨勢，蒸制7 h達到峰值，之后隨蒸制時間延長逐漸降低。

蒸制6～8 h的川烏單酯型生物堿總量基本達到2015版《藥典》所規定的0.070%～0.15%，說明2015版《中國藥典》規定制川烏蒸制6～8 h的合理性。本項實驗以單酯型生物堿為衡量標準，并明確了制川烏蒸制在7h單酯型生物堿總量達到最高。

2.9 驗證實驗

根據上述試驗所得工藝參數，選取3個批號生川烏(批號1904111、1904112、1904121)進行大生產驗證實驗，每批平行操作2次，實驗結果見表5。

表5 3批次制川烏生物堿含量測定結果

通過驗證結果可知，3個批次制川烏符合2015版《中國藥典》所要求的雙酯型生物堿不得過0.040%，單酯型生物堿總量0.070%～0.15%。由實驗研究得到的制川烏工藝參數在大生產中穩定可靠，可為企業批量生產制川烏提供參考。

3 討論

生川烏毒性劇烈，必須經過炮制方能有藥用價值。但針對制川烏2015版《中國藥典》并未給出明確的炮制工藝參數。本文在2015版《中國藥典》的基礎上，運用高效液相色譜法測定制川烏中生物堿總量的多少，探究并優化了制川烏具體炮制工藝參數。

在蒸制時間上，本文對同一批號的川烏進行實驗探究，從蒸制4 h開始，每隔1 h取樣1次，取樣到蒸制9 h，總計6個實驗梯度。結果表明，制川烏在蒸制6 h后雙酯型生物堿已基本檢測不到，單酯型生物堿總量在蒸制4～7 h期間逐漸升高，7 h達到峰值，而后逐漸降低。原因可能是蒸制7 h之前川烏中雙酯型生物堿不斷轉化為單酯型生物堿，從而使其不斷升高；7 h后單酯型生物堿繼續水解為醇胺類物質而沒有雙酯型生物堿繼續轉化。在此建議企業生產制川烏蒸制7 h最佳。

在浸泡時間上，本文根據2015版《中國藥典》規定的“內無干心”進行浸泡，設置4個浸泡時間梯度，實驗了2個不同批號的生川烏，結果表明川烏在浸泡3天后達到2015版《中國藥典》所規定的“內無干心”標準，含量測定結果表明浸泡3天制川烏生物堿含量符合2015版《中國藥典》標準，浸泡時間延長對制川烏生物堿含量影響不大。綜合企業生產效率考慮，建議生產制川烏浸泡時間3天最佳。

綜上所述，制川烏炮制最佳工藝參數為：去除雜質，于室溫下加水浸泡3天，采用蒸制方法隔水蒸制7 h，切片，烘干即得。此工藝參數投入大生產中產出的制川烏性狀、限量、含量都符合2015版《中國藥典》標準，對制川烏的工業化生產具有指導意義。