心腦疏通膠囊中兩種丹參酮類成分的薄層鑒別與含量測定

周 和，張 強，楊輝燦，馮 華，王 奧

(1.遵義市食品藥品檢驗所，貴州 遵義 563002；2.遵義產品質量檢驗檢測院，貴州 遵義 563002)

心腦疏通膠囊是由川芎、丹參、法半夏、杜仲、茯苓等十一味中藥材制成的醫院制劑[1]，具有益氣活血、化瘀通絡之功效，用于氣虛血滯、脈絡瘀阻所致中風后遺癥，半身不遂、肢體麻木及胸痛、胸悶、心悸、眩暈、健忘及心腦血管供血不足等證候者[2]。該中藥復方制劑具有處方復雜、多指標成分協調作用的特點。依據現有研究，丹參中丹參酮類化合物具有抗菌消炎、祛瘀止痛的作用[3-5]，是該制劑發揮功效的指標性成分之一；而現有標準比較簡單，缺乏指標性成分含量的檢測，難以有效控制其質量。因此，本研究建立了心腦疏通膠囊的薄層鑒別與HPLC法同時測定兩種丹參酮類成分的含量[6-9]。薄層鑒別用于判斷投料藥材的真偽，含量測定用于評價指標性成分的多少，以期為心腦疏通膠囊的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜議(安捷倫公司：包括四元泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器，Agilent1260工作站和處理軟件)，Waters XSelect C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；MS204TS型梅特勒電子天平(北京中恒日鑫科技有限公司)；KQ-500DV型數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

丹參酮IIA、隱丹參酮(購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110766-201721、110852-201605)；3批心腦疏通膠囊(批號分別為：161201、161202、161203)購買于遵義市中醫院；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，20170805)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；甲苯(天津市科密歐化學試劑有限公司，20170509)，乙酸乙酯(天津市科密歐化學試劑有限公司，20170512)，乙醚(成都金山化學試劑有限公司，20180202)，均為分析純；硅膠G板(青島海洋化工廠有限公司，20170818)。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

取本品內容物5 g，置索氏提取器中，加入乙醚適量，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺丹參藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取丹參酮ⅡA對照品、隱丹參酮對照品，加乙酸乙酯制成濃度為2 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述3種溶液各6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(18∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結果表明，分離度良好，斑點清晰。見圖1。

注：s.混合對照品溶液；Y.陰性樣品溶液；1-3.樣品溶液

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：waters XSelect C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(洗脫程序，見表1)；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 溶液制備 對照品溶液制備：稱取丹參酮IIA、隱丹參酮對照品適量，分別用甲醇溶解制成含丹參酮IIA 212.63 μg/mL、隱丹參酮47.52 μg/mL的混合對照品儲備液，搖勻，于4 ℃冰箱中保存，備用。再分別精密吸取混合對照品儲備液1、2、5 mL置100 mL容量瓶中，精密吸取混合對照品儲備液1、2 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配置成5個系列的混合對照品溶液(含丹參酮ⅡA：2.126，4.253，10.632，21.263，42.526 μg/mL；隱丹參酮0.475，0.950，2.376，4.752，9.504 μg/mL)，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

供試品溶液制備：取心腦疏通膠囊內容物適量，研細，取約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醚50 mL，靜置24 h(時時振搖)，過濾，濾液蒸干，用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得。

陰性溶液制備：按處方量制成缺丹參藥材的陰性樣品，并按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制成陰性溶液。

2.2.3 系統適用性 取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件依次進樣測定(圖2)。由圖2可知，混合對照品分離良好，理論塔板數高于5 000。供試品溶液基本達到基線分離，陰性樣品無干擾。

圖2 混合對照品(A)、樣品(B)、陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.2.4 線性關系考察 取上述“2.2.2”項下5個系列混合對照品溶液，依次進樣測定，記錄色譜圖，以峰面積(mAU)為縱坐標，以濃度(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線(表2)。由表2可知，兩種丹參酮類成分在線性范圍內線性良好。

表2 線性關系考察結果

2.2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。結果，丹參酮ⅡA和隱丹參酮峰面積RSD分別為0.31%、0.57%(n=6)，表明儀器精密度好。

2.2.6 重復性試驗 取心腦疏通膠囊(批號：161201)內容物適量，按“2.2.2”項制備供試品溶液，共6份，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，丹參酮IIA峰面積的RSD為1.08%(n=6)，隱丹參酮峰面積RSD為1.35%(n=6)，表明重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取心腦疏通膠囊(批號：161201)同一供試品溶液，分別在0、2、5、8、12、24 h進樣檢測，丹參酮ⅡA和隱丹參酮峰面積RSD均小于1.89%(n=6)，表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩定。

2.2.8 加樣回收試驗 取已知含量(丹參酮ⅡA 43.170 μg、隱丹參酮13.038 μg/g)的同一批號心腦疏通膠囊樣品(批號：161201)6份，每份約1.5 g，精密稱定，精密加入丹參酮ⅡA和隱丹參酮對照品適量，按供試品溶液制備的方法操作，進樣檢測并計算回收率(表3)。從結果來看，丹參酮IIA平均回收率為99.31%，RSD為0.43%，隱丹參酮平均回收率為99.78%，RSD為0.89%，表明回收率良好。

表3 加樣回收率試驗 (n=6)

2.2.9 樣品測定 取3批心腦疏通膠囊，按“2.2.2”項下條件制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定心腦疏通膠囊中兩種丹參酮類成分的含量，見表4。

表4 樣品含量 (n=3)

3 討論

丹參酮類是丹參中脂溶性成分，包括丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I等[7]，因此，本研究對比考察了甲醇、乙醚兩種有機溶劑作為提取溶劑的試驗結果?？疾旖Y果表明，由于心腦疏通膠囊中藥味多，甲醇提取液的色譜峰繁雜，不易分離；以乙醚提取、甲醇溶解時，基線較平穩，各色譜峰保留時間適中，故選擇乙醚提取。在色譜圖中，成功定位出了丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I三種丹參酮類成分，其中，以丹參酮IIA和隱丹參酮含量較高，利于定量檢測分析，方法學考察結果亦符合要求。此外，經多次梯度洗脫模式摸索，對甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙睛-水、乙睛-磷酸溶液、乙睛-醋酸溶液6個流動相考察發現：乙腈-0.1%磷酸溶液對樣品成分的梯度洗脫效果最好。本研究首次建立了心腦疏通膠囊中丹參酮類成分的薄層色譜鑒別和含量測定，該方法簡便、準確、重現性好，可為心腦疏通膠囊的質量控制提供參考。