基于HPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS技術的復方魚腥草合劑化學物質基礎表征研究

何厚洪，姚建標，暢文琦，王建方，應 珂，羅婷婷，金漢臺，薛 瑾，王如偉*

(1.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江 杭州 310052；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400)

復方魚腥草合劑由魚腥草、黃芩、板藍根、金銀花、連翹五味中藥組成，在臨床上主要用于外感風熱引起的急性咽炎、扁桃腺炎。截至目前，部頒標準中復方魚腥草合劑的含量測定僅以黃芩苷作為指標，而復方中成藥具有多成分、復雜的特點，單一指標已不足以全面反映和控制合劑的質量。目前，對于復方魚腥草的質量研究多為單一或少數幾個指標，如黃芩苷、連翹苷、綠原酸等的HPLC含量測定[1-2]或指紋圖譜研究[3]，缺乏對復方魚腥草合劑整體化學物質基礎的系統研究。

為了快速系統鑒定復方魚腥草合劑中的化學物質成分，本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技術對復方魚腥草合劑進行定性分析，快速鑒別復方魚腥草中的化學成分，并對鑒定出的成分進行藥味與大類成分的歸屬，為提升復方魚腥草合劑的質量標準及藥理作用機制的研究提供基礎和方向。

1 材料

1.1 儀器

戴安 UltiMate 3000超高效液相-軌道質譜聯用儀，包括在線脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱、可變波長檢測器以及ESI離子源。

1.2 藥材與試劑

甲醇(色譜純，Merck)；甲酸(色譜純，百靈威)；試驗用水為Milli-Q系統制備(電阻率18.2 MΩ，25 ℃)。對照品黃芩苷(批號110715-201821)、漢黃芩苷(批號112002-201702)、漢黃芩素(批號111514-201706)、連翹酯苷A(批號111810-201707)、連翹酯苷B(批號111811-201603)、當藥苷(批號111742-200501)、異槲皮苷(批號111809-201804)、綠原酸(批號110753-201817)、金絲桃苷(批號111521-201809)、槲皮苷(批號111538-201606)、連翹苷(批號110821-201816)均購自中國食品藥品檢定研究院。魚腥草(批號Z001a-180301)、黃芩(批號1804004)、板藍根(批號Z003c-180401)、金銀花(批號1803002)、連翹(批號Z004b-180301)、復方魚腥草合劑(批號B181001)均由浙江康恩貝中藥有限公司提供。

2 方法

2.1 色譜質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～5 min，5%B；5 ～10 min，5% B→20% B；10～20 min，20% B→ 30% B；20～30 min，30% B→38% B；30～38 min，38% B；38～60 min，38% B→55% B；60～65 min，55% B→65% B；65～66 min，65% B→95% B；66～70 min，95% B。然后接著運行10 min；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源溫度：350 ℃(±)；鞘氣流速：40 arb(+)，35arb(-)；保護氣流速：10 arb(±)；尾吹氣流速：0 arb(±)；噴霧電壓：3.2 kV(±)；毛細管溫度：325 ℃(+)，300 ℃(-)。所有樣品數據采集均采用全掃描模式，分辨率為 60 000 FWHM。一級全掃描質量數范圍m/z 120～1 200；二級采用數據依賴性掃描，設置閾值1 000以上的母離子作為掃描對象，動態排除時間設為15 s，重復掃描次數設為 2次，重復掃描時間設為15 s，碰撞誘導解離電壓為35 V。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹酯苷A、連翹酯苷B、當藥苷、異槲皮苷、綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷、連翹苷對照品適量，加甲醇制備終濃度均約為50 μg·mL-1的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材魚腥草2 g、黃芩2 g、板藍根2 g、金銀花2 g和連翹2 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加水煎煮2次，合并煎煮液，減壓濃縮至密度約為1.2，加入適量86%乙醇至藥液中酒精含量為70%，醇沉靜置過夜，藥液過濾后減壓濃縮至無醇味，置于4 ℃冰箱保存。臨用前用純水稀釋10倍，濾過，取續濾液，即得各藥材供試品溶液。將復方魚腥草合劑直接濾過，取續濾液，即得合劑供試品溶液。

3 結果

采用建立的HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS方法對復方魚腥草合劑進行了分析，其正負離子模式下的總離子流見圖1。

圖1 復方魚腥草合劑正負離子模式下總離子流

根據正負離子模式下的一級質譜，確定其分子離子峰，在此基礎上，進一步分析其二級碎片信息，可推斷化合物的部分結構。最后比較對照品的色譜質譜行為，確認化合物。若無相應對照品，還需要比對合劑與各藥材的總離子流圖，先確認峰歸屬，再通過pubmed、hmdb、massbank等化學數據庫以及對應藥材的相關文獻[4-17]推斷最有可能的化合物。最終從復方魚腥草合劑中歸屬了107個化學成分，其中包括7個氨基酸，11個苯乙醇苷，3個核苷，11個環烯醚萜，39個黃酮、12個木脂素、8個生物堿、14個有機酸，另有2個輔料峰。進一步對化合物進行藥味歸屬，最終在魚腥草中歸屬了22個，黃芩中40個，板藍根中27個，連翹中31個，金銀花中32個，部分化合物存在于多味藥材中。各化合物的基本信息見表1。

表1 復方魚腥草合劑化學物質基礎表征

(續表1)

(續表1)

(續表1)

從歸屬結果看，部分化合物來源與藥材也具有一定的對應性。如黃酮主要來源于黃芩，環烯醚萜主要來源于金銀花，苯乙醇苷主要來源于連翹等，這些化合物普遍具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強免疫等藥理活性[18-20]，以下為該三類特征化合物的基本裂解模式。

3.1 黃酮類化合物

從復方魚腥草合劑中共鑒定出黃酮類成分39個，其中黃酮苷的二級質譜圖具有特征性，一般呈現出較高的苷元的信號響應。例如黃芩苷(83)分子離子[M+H]+為447.091 4，負離子模式下的一級譜中還可見[2M-H]-m/z 891.157 8與源內裂解產生的苷元信號m/z 269.044 6。通過Xcalibur軟件推斷可能的分子式為C21H18O11，偏差在5 ppm以內。在二級質譜圖中可見m/z 269.045 4 [M-178-H]-，可能為脫去一分子葡萄糖醛酸，結合對照品比對確認該峰確為黃芩苷。黃酮苷元則可能發生RDA裂解，產生特征的碎片離子，如白楊素(104)分子離子[M+H]+為255.065 7，[M-H]-為253.050 5，根據精確分子量推測化學式為C15H10O4。在二級質譜圖中可見m/z 153.018 5 [M-C8H6+H]+，為黃酮苷元發生RDA裂解產生的1，3A+碎片。

(a)黃芩苷(b)白楊素

3.2 環烯醚萜類化合物

從復方魚腥草合劑中共鑒定出環烯醚萜類成分11個，主要來源于金銀花。以馬錢苷酸(22)為例，其分子離子[M+Na]+為399.125 8，[M-H]-為375.129 6，根據精確分子量推測分子式為C16H24O10。二級質譜圖中可見m/z 213.076 7為 [M-162-H]-，結構中可能存在一分子六碳糖，m/z 169.087 1母核脫去CO2，m/z 151.0764為進一步脫去一分子水。結合文獻報道，推測該化合物為馬錢苷酸，而另一個同分異構體為7-epi馬錢苷酸。

3.3 苯乙醇苷類化合物

從復方魚腥草合劑中共鑒定出苯乙醇苷類成分11個，主要來源于連翹。以連翹酯苷A(51)為例，其分子離子[M+Na]+為647.194 6，[M-H]-為623.194 6，根據精確分子量推測分子式為C29H36O15。二級質譜圖中可見m/z 461.165 6為[M-C9H8O3-H]-，m/z 443.155 9為[M - C9H8O3-H2O-H]-，推測結構中含有一分子六碳糖，另可見m/z 315.108 5的二羥基苯乙醇苷母核碎片。結合對照品比對，確認該峰確為連翹酯苷A。

圖3 環烯醚萜類成分典型裂解模式示例

4 討論

中藥具有療效好、成本低、相對低毒性的特點，但其復雜的化學成分及藥效物質不明確致使中藥質量控制與藥理機制研究困難重重，因此對中藥及其相關制劑進行全面的化學表征非常必要，對于明確藥效物質基礎及其作用機制研究意義重大。隨著質譜技術的發展，實現高效準確的復雜體系快速分析成為可能，通過化合物的質譜一級、二級信息，可快速獲取其結構信息，同時結合龐大的數據庫還可以探索未知成分、挖掘中藥中潛在的有效物質。色譜-質譜聯用技術應用于化合物結構鑒定可為中藥多組分鑒定研究提供更可靠的依據。

本研究通過建立HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS方法，初步鑒定了復方魚腥草合劑中107個化合物，首次系統明確了復方魚腥草合劑的整體化學物質基礎，實現了對復方魚腥草合劑成分的快速定性分析，且該方法快速、簡便、靈敏度高。此外，藥味歸屬的結果反映了合劑中各藥材的特征性成分，如槲皮苷(魚腥草)、9(S)，10(S)，11(R)-三羥基-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸(板藍根)、連翹苷(連翹)、黃芩苷(黃芩)、獐芽菜苷(金銀花)等，對合劑質控指標的篩選和質量標準的提升具有重要作用，為彌補復方魚腥草合劑單一檢測指標的不足提供依據。通過結合相關化合物的藥理活性報道，可以側面反映復方魚腥草合劑抗炎、抗菌等作用，對于合劑藥效物質基礎的闡明也具有重要意義。

圖4 苯乙醇苷類成分典型裂解模式示例