復方荊參溶液微生物限度檢查方法考察

史黎萍 ，徐 軍，徐燕豐，張立超，李 毅

(1.上海市中醫醫院 制劑室，上海 200000；2.上海市靜安區食品藥品檢驗所，上海 200000)

復方荊參溶液是上海市中醫醫院皮膚科原主任顧乃芳的家傳經驗方劑，主要用于治療鵝掌風、腳濕氣，尤其對于角化過度型的患者具有獨特的治療功效，一般用法是在夏季進行浸泡，治療手足癬，尤其是角化過度型手足癬[1]。對革蘭陽性細菌、真菌和念珠菌具有顯著的抗菌活性，用藥安全性高，應用前景廣闊[2]。2015版《中國藥典》中對非無菌產品微生物控制標準與國際標準趨于一致，與國際ICH要求統一協調，另外《中國藥典》也強調了藥品無菌與微生物限度檢查方法的建立和驗證方面的標準[3]。本文按照《中國藥典》通則要求[4]對復方荊參溶液的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，以及控制菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查方法進行了適用性試驗，以期為《中國藥典》中有關內容的貫徹執行提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器，SPX-100B-2生化培養箱(上海博訊實業有限公司)；BHC-1000A/B2生物安全柜，SW-CJ-1F凈化工作臺(吳江生信空氣凈化設備廠)；T3000Y電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；MJX-250霉菌培養箱(上海申賢恒溫設備廠)；SQP型電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KD3090A2電動吸引器(武漢科爾達醫療科技有限公司)；無菌檢查薄膜濾器(浙江寧海白石藥檢儀器廠)。

1.2 樣品

復方荊參溶液(500 mL/瓶，上海市中醫醫院)(生產批次20180103、20180111、20180119)。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：3303077)，沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：3303027)，胰酪大豆胨液體培養基(批號：3303107)，沙氏葡萄糖液體培養基(批號：3302126)均購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501]，白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉[CMCC(F) 98 003]購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.5 稀釋液及沖洗液

pH=7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖溶液(批號：3302140，廣東環凱微生物科技有限公司)含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80(批號：101720160905，湖南爾康制藥股份有限公司)的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于“1.3”項下中胰酪大豆胨液體培養基中，30～35 ℃培養24 h；白色念珠菌則接種于沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25 ℃培養72天。上述培養物用“1.5”項下的緩沖溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，20～25 ℃培養7天，加入5 mL “1.5”項下的緩沖溶液，將孢子進行洗脫，收集孢子懸液，用“1.5”項下含0.05%(mL/mL)緩沖溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10 mL，加pH=7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖溶液至100 mL，制成1∶10供試液。

2.3 需氧菌計數方法適用性試驗

2.3.1 方法選擇 因采用平皿法需氧菌總數、霉菌酵母菌菌總數回收率未達到0.5～2，故采用薄膜過濾法。

2.3.2 接種 ①試驗組取制備好的1∶10供試液1 mL薄膜過濾法過濾，每張薄膜用沖洗液分別試驗沖洗1次2次、3次，每次100 mL/次。最后一次沖洗液中分別加入≤100 cfu/mL 5種試驗菌液1 mL；②供試品對照組取制備好的1∶10供試液1 mL，不加入試驗菌；③菌液對照組不加供試品，步驟同試驗組。取制備好的濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆瓊脂培養基上，按規定條件倒置培養，計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數，計算各組平均菌落數。

2.3.3 結果 試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值在0.5～2范圍內，供試品需氧菌總數計數方法適用性試驗通過，見表1。

表1 需氧菌總數測定供試品微生物回收試驗結果 (1∶10供試液)

表1結果顯示，五種試驗菌的回收試驗符合藥典要求，可取1∶10供試液1 mL薄膜法沖洗300 mL進行該供試品的需氧菌總數計數方法適用性試驗通過。

2.4 霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗

方法同需氧菌總數適用性試驗。試驗菌為白色念珠菌和黑曲霉，結果見表2。

表2 霉菌和酵母菌總數測定供試品微生物回收試驗結果 (1∶10供試液)

表2結果顯示，白色念珠菌和黑曲霉試驗菌的回收試驗符合藥典要求，可取1∶10供試液1 mL薄膜法沖洗100 mL進行該供試品的霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗通過。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

控制菌采用金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中，30～35 ℃培養24 h，后取1∶10供試液10 mL接種至胰酪大豆胨液體培養基100 mL中(接入的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌試驗菌液各1 mL，其中含菌量≤100 cfu)，混勻，30～35 ℃培養18 h。取金黃色葡萄球菌培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，銅綠假單胞菌培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30～35 ℃培養18 h。結果見表3、表4。

表3結果顯示，試驗組檢出金黃色葡萄球菌試驗菌，該供試品的金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗通過。

表3 金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗結果

表4結果顯示，試驗組檢出銅綠假單胞菌，該供試品的銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗通過。

表4 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

藥品安全控制之一在于對其進行微生物的限度檢查，隨著我國藥品標準與國際標準逐漸接軌，微生物限度檢查方法得到不斷完善，標準不斷提高，在我國2015版的《中國藥典》中將“微生物限度檢查方法驗證”修改為“方法適用性檢查”，更加準確以及科學地反映了微生物限度檢查的特點[5]。前者強調方法學的可行性，后者則更加強調突出試驗條件、供試品等多因素整體性系統評價[6-7]，微生物限度檢查是系統性的工作，方法適用性試驗必不可少[8-9]。

本次試驗中需氧菌總數測定取本品10 mL，以pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液為稀釋液，制成1∶10供試液，取1∶10供試液1 mL薄膜過濾，每張慮膜用pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，100 mL/次。按照“非無菌產品微生物限度檢查：計數檢查法(通則1105)”檢查，應符合“非無菌藥品微生物限度標準(通則1107)”規定。霉菌和酵母菌總數測定取本品10 mL，以pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液為稀釋液，制成1∶10供試液，取1∶10供試液1 mL薄膜過濾，每張慮膜用pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗1次，100 mL/次。按照“非無菌產品微生物限度檢查：計數檢查法(通則1105)”檢查，應符合“非無菌藥品微生物限度標準(通則1107)”規定。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌按照需氧菌總數測定方法制備1∶10供試液，取其中的10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，按照“非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法(通則1106)”進行檢查，并且同時應符合“非無菌藥品微生物限度標準(通則1107)”中的規定。

總之，本試驗中復方荊參溶液的需氧菌、霉菌和酵母菌總數、控制菌等檢查結果均符合該品種項下的規定，可為復方荊參溶液微生物限度檢查方法的中藥復方制劑在檢查方法的建立方面提供參考[10]。